24小时热门版块排行榜    

查看: 2202  |  回复: 10

lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)

[求助] 关于PCR扩不出的问题,求大神解答 已有5人参与

大家好:我现在PCR的时候遇到了一个问题,我根据小麦转录组测序的结果,想设计几对引物做荧光定量,扩增长度大约100bp左右。但是,我想先用基因组DNA,用普通的PCR仪摸一下条件,却怎么也扩不出目的带(只有模糊的引物带),用touchdown程序也不行。用cDNA直接荧光定量更是定不出来,可我设计引物的时候都尽量避开了引物二聚体或者错配,这是咋回事啊?求大神解答,着急啊
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2014-01-25 04:02:14
lwk5716: 金币+1, 有帮助 2014-01-28 15:51:32
你是根据cDNA序列设计的引物有可能在gDNA上不工作。你可以先用引物在你cDNA上做一下普通PCR,同时多设计几对引物,毕竟定量引物工作要求比较高。
hehe
5楼2014-01-24 19:46:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

冰封之real

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
lwk5716: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-01-28 15:54:23
既然是小麦基因组,那LZ就得考虑内含子的问题,要试也不能拿基因组试,而是用cDNA进行普通PCR,如果能得到所需条带,再上荧光定量PCR。如果得不到,那就是引物有问题(也有可能是cDNA有问题,不过这个可能性不大)
8楼2014-01-26 09:29:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

若溪

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-01-24 16:11:08
我觉得你可以先用通用引物进行PCR,以确认模板没有问题,如果模板没有问题那就可能是引物本身设计的有问题
没有比脚更长的路,没有比人更高的山
2楼2014-01-24 15:46:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)

我的序列来自转录组测序,只是部分的mRNA序列,我是根据这个序列设计的。还有,怎么用通用引物PCR?
3楼2014-01-24 19:04:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 若溪 at 2014-01-24 15:46:37
我觉得你可以先用通用引物进行PCR,以确认模板没有问题,如果模板没有问题那就可能是引物本身设计的有问题

我的序列来自转录组测序,只是部分的mRNA序列,我是根据这个序列设计的。还有,怎么用通用引物PCR?
4楼2014-01-24 19:04:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yyshpy007

禁虫 (正式写手)

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励交流! 2014-01-25 04:02:46
lwk5716: 金币+1, 有帮助 2014-01-28 15:51:46
本帖内容被屏蔽

6楼2014-01-24 22:41:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
lwk5716: 金币+1, 有帮助 2014-01-28 15:52:43
实际上你是拿RNA为模板来设计引物,产物长度为100bp,你有看过你设计的引物在基因组序列上的位置吗,万一它们跨内含子而使PCR产物变得很长,而你扩增不出来是你延伸时间不够导致的

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
7楼2014-01-25 04:06:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by lvbobo823 at 2014-01-24 19:46:39
你是根据cDNA序列设计的引物有可能在gDNA上不工作。你可以先用引物在你cDNA上做一下普通PCR,同时多设计几对引物,毕竟定量引物工作要求比较高。

嗯,谢谢你。
9楼2014-01-28 15:49:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by gyesang at 2014-01-25 04:06:59
实际上你是拿RNA为模板来设计引物,产物长度为100bp,你有看过你设计的引物在基因组序列上的位置吗,万一它们跨内含子而使PCR产物变得很长,而你扩增不出来是你延伸时间不够导致的
...

嗯,是的。不过,现在基因组数据不全,我延长一下时间试试吧,谢谢你。
10楼2014-01-28 15:54:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 lwk5716 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 今天务委会开完了,明天出结果吗 +7 angus9576 2026-08-25 7/350 2026-08-25 15:50 by Weed114114
[基金申请] 今日不放榜?网传国自然预计 8 月 27 日可查结果 +17 医学老男孩 2026-08-20 22/1100 2026-08-25 15:36 by 医学老男孩
[基金申请] 在坚冰还盖着北海的时候,我看到了怒放的梅花。 +4 ziyangfang 2026-08-25 6/300 2026-08-25 15:07 by huagongfeihu
[基金申请] 放榜前的不淡定 20+4 snowwithsea 2026-08-19 18/900 2026-08-25 14:50 by Weed114114
[基金申请] 什么时候开奖? +12 CrisMessi 2026-08-18 13/650 2026-08-25 14:40 by ZJTJZ
[基金申请] 如果此刻你正在为国基感到焦虑,不妨来听听这首《基金之外》 +8 scalable 2026-08-24 8/400 2026-08-25 12:52 by jnhyjjm
[基金申请] 没有任何消息-是不是就凉了 +9 图啦图啦 2026-08-24 10/500 2026-08-25 11:59 by 南海小哥
[基金申请] 人气不行了 +11 fansofjerry 2026-08-21 11/550 2026-08-25 11:04 by 孤独的英雄6
[基金申请] 2026年的国家社科基金项目通讯评审的新规则与新动向、新挑战 +5 process2012 2026-08-23 7/350 2026-08-25 09:42 by huixian257
[基金申请] 今天基金会出结果吗?20260819 +17 kkkl_v 2026-08-19 18/900 2026-08-25 09:41 by windflowerwy
[基金申请] 我面上完蛋了 +13 且听虎啸 2026-08-20 14/700 2026-08-25 09:10 by mrkang
[基金申请] 范进中举一文的中心思想 +7 炎黄贵胄 2026-08-22 8/400 2026-08-25 08:48 by ZJTJZ
[基金申请] 明天应该可查了!? +5 chengyan1220 2026-08-23 5/250 2026-08-24 23:28 by 我4大白菜
[基金申请] filecode,4个jtjc了 +14 ziyangfang 2026-08-19 17/850 2026-08-24 18:37 by 哈哈蛤?
[基金申请] 建议基金发布提前给出明确的时间点 +13 kulium 2026-08-21 16/800 2026-08-24 16:27 by superceng
[基金申请] 今天放榜吗? +15 布布和一二 2026-08-19 16/800 2026-08-23 09:55 by 张春生
[基金申请] 时间戳今天,20号变了 +5 archvillain 2026-08-20 5/250 2026-08-22 06:12 by hui_daxiao
[基金申请] 应该是下周三26日公布了吧? +4 哈哈蛤? 2026-08-21 4/200 2026-08-21 10:58 by Vivilian
[基金申请] 今天放榜没戏了吧 +9 yuleib84 2026-08-19 11/550 2026-08-21 10:06 by gltch
[基金申请] 基金啊基金 +4 longfie172 2026-08-20 4/200 2026-08-21 08:58 by mark mao
信息提示
请填处理意见