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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 关于PCR扩不出的问题，求大神解答
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lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)

[求助] 关于PCR扩不出的问题，求大神解答 已有5人参与

大家好：我现在PCR的时候遇到了一个问题，我根据小麦转录组测序的结果，想设计几对引物做荧光定量，扩增长度大约100bp左右。但是，我想先用基因组DNA，用普通的PCR仪摸一下条件，却怎么也扩不出目的带（只有模糊的引物带），用touchdown程序也不行。用cDNA直接荧光定量更是定不出来，可我设计引物的时候都尽量避开了引物二聚体或者错配，这是咋回事啊？求大神解答，着急啊
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1楼 2014-01-24 13:04:57
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-01-25 04:02:14
lwk5716: 金币+1, ★有帮助 2014-01-28 15:51:32
你是根据cDNA序列设计的引物有可能在gDNA上不工作。你可以先用引物在你cDNA上做一下普通PCR，同时多设计几对引物，毕竟定量引物工作要求比较高。
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hehe
5楼2014-01-24 19:46:39
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冰封之real

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lwk5716: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-01-28 15:54:23
既然是小麦基因组，那LZ就得考虑内含子的问题，要试也不能拿基因组试，而是用cDNA进行普通PCR，如果能得到所需条带，再上荧光定量PCR。如果得不到，那就是引物有问题（也有可能是cDNA有问题，不过这个可能性不大）
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8楼2014-01-26 09:29:32
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若溪

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-01-24 16:11:08
我觉得你可以先用通用引物进行PCR，以确认模板没有问题，如果模板没有问题那就可能是引物本身设计的有问题
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没有比脚更长的路，没有比人更高的山
2楼2014-01-24 15:46:37
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lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)
我的序列来自转录组测序，只是部分的mRNA序列，我是根据这个序列设计的。还有，怎么用通用引物PCR？
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3楼2014-01-24 19:04:10
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lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 若溪 at 2014-01-24 15:46:37
我觉得你可以先用通用引物进行PCR，以确认模板没有问题，如果模板没有问题那就可能是引物本身设计的有问题

我的序列来自转录组测序，只是部分的mRNA序列，我是根据这个序列设计的。还有，怎么用通用引物PCR？
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4楼2014-01-24 19:04:39
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yyshpy007

禁虫 (正式写手)
★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2014-01-25 04:02:46
lwk5716: 金币+1, ★有帮助 2014-01-28 15:51:46
本帖内容被屏蔽
6楼2014-01-24 22:41:19
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
lwk5716: 金币+1, ★有帮助 2014-01-28 15:52:43
实际上你是拿RNA为模板来设计引物，产物长度为100bp，你有看过你设计的引物在基因组序列上的位置吗，万一它们跨内含子而使PCR产物变得很长，而你扩增不出来是你延伸时间不够导致的

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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7楼2014-01-25 04:06:59
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lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by lvbobo823 at 2014-01-24 19:46:39
你是根据cDNA序列设计的引物有可能在gDNA上不工作。你可以先用引物在你cDNA上做一下普通PCR，同时多设计几对引物，毕竟定量引物工作要求比较高。

嗯，谢谢你。
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9楼2014-01-28 15:49:24
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lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by gyesang at 2014-01-25 04:06:59
实际上你是拿RNA为模板来设计引物，产物长度为100bp，你有看过你设计的引物在基因组序列上的位置吗，万一它们跨内含子而使PCR产物变得很长，而你扩增不出来是你延伸时间不够导致的
...

嗯，是的。不过，现在基因组数据不全，我延长一下时间试试吧，谢谢你。
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10楼2014-01-28 15:54:08
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