24小时热门版块排行榜    

查看: 1735  |  回复: 10

lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)

[求助] 关于PCR扩不出的问题,求大神解答 已有5人参与

大家好:我现在PCR的时候遇到了一个问题,我根据小麦转录组测序的结果,想设计几对引物做荧光定量,扩增长度大约100bp左右。但是,我想先用基因组DNA,用普通的PCR仪摸一下条件,却怎么也扩不出目的带(只有模糊的引物带),用touchdown程序也不行。用cDNA直接荧光定量更是定不出来,可我设计引物的时候都尽量避开了引物二聚体或者错配,这是咋回事啊?求大神解答,着急啊
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2014-01-25 04:02:14
lwk5716: 金币+1, 有帮助 2014-01-28 15:51:32
你是根据cDNA序列设计的引物有可能在gDNA上不工作。你可以先用引物在你cDNA上做一下普通PCR,同时多设计几对引物,毕竟定量引物工作要求比较高。
hehe
5楼2014-01-24 19:46:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

冰封之real

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
lwk5716: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-01-28 15:54:23
既然是小麦基因组,那LZ就得考虑内含子的问题,要试也不能拿基因组试,而是用cDNA进行普通PCR,如果能得到所需条带,再上荧光定量PCR。如果得不到,那就是引物有问题(也有可能是cDNA有问题,不过这个可能性不大)
8楼2014-01-26 09:29:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

若溪

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-01-24 16:11:08
我觉得你可以先用通用引物进行PCR,以确认模板没有问题,如果模板没有问题那就可能是引物本身设计的有问题
没有比脚更长的路,没有比人更高的山
2楼2014-01-24 15:46:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)

我的序列来自转录组测序,只是部分的mRNA序列,我是根据这个序列设计的。还有,怎么用通用引物PCR?
3楼2014-01-24 19:04:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 若溪 at 2014-01-24 15:46:37
我觉得你可以先用通用引物进行PCR,以确认模板没有问题,如果模板没有问题那就可能是引物本身设计的有问题

我的序列来自转录组测序,只是部分的mRNA序列,我是根据这个序列设计的。还有,怎么用通用引物PCR?
4楼2014-01-24 19:04:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yyshpy007

禁虫 (正式写手)

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励交流! 2014-01-25 04:02:46
lwk5716: 金币+1, 有帮助 2014-01-28 15:51:46
本帖内容被屏蔽

6楼2014-01-24 22:41:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
lwk5716: 金币+1, 有帮助 2014-01-28 15:52:43
实际上你是拿RNA为模板来设计引物,产物长度为100bp,你有看过你设计的引物在基因组序列上的位置吗,万一它们跨内含子而使PCR产物变得很长,而你扩增不出来是你延伸时间不够导致的

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
7楼2014-01-25 04:06:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by lvbobo823 at 2014-01-24 19:46:39
你是根据cDNA序列设计的引物有可能在gDNA上不工作。你可以先用引物在你cDNA上做一下普通PCR,同时多设计几对引物,毕竟定量引物工作要求比较高。

嗯,谢谢你。
9楼2014-01-28 15:49:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by gyesang at 2014-01-25 04:06:59
实际上你是拿RNA为模板来设计引物,产物长度为100bp,你有看过你设计的引物在基因组序列上的位置吗,万一它们跨内含子而使PCR产物变得很长,而你扩增不出来是你延伸时间不够导致的
...

嗯,是的。不过,现在基因组数据不全,我延长一下时间试试吧,谢谢你。
10楼2014-01-28 15:54:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 lwk5716 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 281求调剂(0805) +6 烟汐忆海 2026-03-16 16/800 2026-03-19 00:59 by 烟汐忆海
[考研] 330求调剂 +3 小材化本科 2026-03-18 3/150 2026-03-18 21:55 by 无懈可击111
[考研] 【同济软件】软件(085405)考研求调剂 +3 2026eternal 2026-03-18 3/150 2026-03-18 19:09 by 搏击518
[考研] 311求调剂 +6 26研0 2026-03-15 6/300 2026-03-18 14:43 by haxia
[考研] 304求调剂 +12 小熊joy 2026-03-14 13/650 2026-03-18 12:34 by Linda Hu
[考研] 0703化学调剂 +4 pupcoco 2026-03-17 7/350 2026-03-18 12:14 by djl2006
[考研] 材料专硕326求调剂 +6 墨煜姒莘 2026-03-15 7/350 2026-03-17 17:10 by ruiyingmiao
[考研] 梁成伟老师课题组欢迎你的加入 +8 一鸭鸭哟 2026-03-14 10/500 2026-03-17 15:07 by 一鸭鸭哟
[考研] 一志愿苏州大学材料工程(085601)专硕有科研经历三项国奖两个实用型专利一项省级立项 +6 大火山小火山 2026-03-16 8/400 2026-03-17 15:05 by 无懈可击111
[考研] 283求调剂 +3 听风就是雨; 2026-03-16 3/150 2026-03-17 07:41 by 热情沙漠
[考研] 11408 一志愿西电,277分求调剂 +3 zhouzhen654 2026-03-16 3/150 2026-03-17 07:03 by laoshidan
[考研] [导师推荐]西南科技大学国防/材料导师推荐 +3 尖角小荷 2026-03-16 6/300 2026-03-16 23:21 by 尖角小荷
[考研] 药学383 求调剂 +3 药学chy 2026-03-15 4/200 2026-03-16 20:51 by 元子^0^
[考研] 085601材料工程315分求调剂 +3 yang_0104 2026-03-15 3/150 2026-03-15 10:58 by peike
[考研] 求材料调剂 085600英一数二总分302 前三科235 精通机器学习 一志愿哈工大 +4 林yaxin 2026-03-12 4/200 2026-03-13 22:04 by 星空星月
[考研] 求调剂 +5 一定有学上- 2026-03-12 5/250 2026-03-13 18:31 by ms629
[考研] 工科278分求调剂 +5 周慢热啊 2026-03-12 7/350 2026-03-13 15:49 by JourneyLucky
[考研] 085600材料与化工 309分请求调剂 +7 dtdxzxx 2026-03-12 8/400 2026-03-13 14:43 by jxchenghu
[考研] 一志愿山大07化学 332分 四六级已过 本科山东双非 求调剂! +3 不想理你 2026-03-12 3/150 2026-03-13 14:18 by JourneyLucky
[考研] 289求调剂 +3 李政莹 2026-03-12 3/150 2026-03-13 11:02 by 求调剂zz
信息提示
请填处理意见