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lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)

[求助] 关于PCR扩不出的问题,求大神解答 已有5人参与

大家好:我现在PCR的时候遇到了一个问题,我根据小麦转录组测序的结果,想设计几对引物做荧光定量,扩增长度大约100bp左右。但是,我想先用基因组DNA,用普通的PCR仪摸一下条件,却怎么也扩不出目的带(只有模糊的引物带),用touchdown程序也不行。用cDNA直接荧光定量更是定不出来,可我设计引物的时候都尽量避开了引物二聚体或者错配,这是咋回事啊?求大神解答,着急啊
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2014-01-25 04:02:14
lwk5716: 金币+1, 有帮助 2014-01-28 15:51:32
你是根据cDNA序列设计的引物有可能在gDNA上不工作。你可以先用引物在你cDNA上做一下普通PCR,同时多设计几对引物,毕竟定量引物工作要求比较高。
hehe
5楼2014-01-24 19:46:39
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冰封之real

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
lwk5716: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-01-28 15:54:23
既然是小麦基因组,那LZ就得考虑内含子的问题,要试也不能拿基因组试,而是用cDNA进行普通PCR,如果能得到所需条带,再上荧光定量PCR。如果得不到,那就是引物有问题(也有可能是cDNA有问题,不过这个可能性不大)
8楼2014-01-26 09:29:32
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普通回帖

若溪

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-01-24 16:11:08
我觉得你可以先用通用引物进行PCR,以确认模板没有问题,如果模板没有问题那就可能是引物本身设计的有问题
没有比脚更长的路,没有比人更高的山
2楼2014-01-24 15:46:37
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lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)

我的序列来自转录组测序,只是部分的mRNA序列,我是根据这个序列设计的。还有,怎么用通用引物PCR?
3楼2014-01-24 19:04:10
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lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 若溪 at 2014-01-24 15:46:37
我觉得你可以先用通用引物进行PCR,以确认模板没有问题,如果模板没有问题那就可能是引物本身设计的有问题

我的序列来自转录组测序,只是部分的mRNA序列,我是根据这个序列设计的。还有,怎么用通用引物PCR?
4楼2014-01-24 19:04:39
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yyshpy007

禁虫 (正式写手)

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励交流! 2014-01-25 04:02:46
lwk5716: 金币+1, 有帮助 2014-01-28 15:51:46
本帖内容被屏蔽

6楼2014-01-24 22:41:19
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
lwk5716: 金币+1, 有帮助 2014-01-28 15:52:43
实际上你是拿RNA为模板来设计引物,产物长度为100bp,你有看过你设计的引物在基因组序列上的位置吗,万一它们跨内含子而使PCR产物变得很长,而你扩增不出来是你延伸时间不够导致的

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
7楼2014-01-25 04:06:59
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lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by lvbobo823 at 2014-01-24 19:46:39
你是根据cDNA序列设计的引物有可能在gDNA上不工作。你可以先用引物在你cDNA上做一下普通PCR,同时多设计几对引物,毕竟定量引物工作要求比较高。

嗯,谢谢你。
9楼2014-01-28 15:49:24
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lwk5716

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by gyesang at 2014-01-25 04:06:59
实际上你是拿RNA为模板来设计引物,产物长度为100bp,你有看过你设计的引物在基因组序列上的位置吗,万一它们跨内含子而使PCR产物变得很长,而你扩增不出来是你延伸时间不够导致的
...

嗯,是的。不过,现在基因组数据不全,我延长一下时间试试吧,谢谢你。
10楼2014-01-28 15:54:08
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