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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 动植物 » 综合其他 » 半定量PCR内参
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小孽博士

新虫 (小有名气)

[求助] 半定量PCR内参 已有2人参与

做半定量PCR，提RNA反转录成cDNA后扩actin，带非常亮。扩目的基因带时有两条带，经比对后鉴定大的那条是基因组带，小的那条是cDNA带，大小吻合，说明提RNA过程中有DNA未消化干净，cDNA中混有DNA污染。鉴于样本比较多，重新提RNA较麻烦，想了一个办法，请各位虫友帮忙看是否可行。本实验室所用内参为actin2，想在设计actin引物时设计两条跨内含子的引物，j基因组带比cDNA带要长将近200bp, 这样扩actin 的时候就会有两条带，一条基因组带，一条cDNA带。然后我只将cDNA带的亮度调一致，可以认为这就是总cDNA的内参吗？大家觉得可以吗？
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千磨万击还坚劲，任尔东西南北风
1楼 2014-01-13 21:14:57
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小孽博士: 金币+5, ★有帮助 2014-02-19 20:16:09
不建议这么做。因为当有不同模板竞争引物时，扩增效率可能会降低，会影响定量结果。你可以把为消化干净gDNAd的RNA重新消化，再做反转录。
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4楼2014-01-13 23:58:58
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小孽博士: 金币+5, ★有帮助 2014-02-19 20:16:23
我觉得可以，引物肯定是过量的，但有时会不会出现特殊结构使引物更倾向于结合gDNA而导致cDNA扩增量不足。
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hehe
2楼2014-01-13 21:51:02
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小孽博士

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lvbobo823 at 2014-01-13 21:51:02
我觉得可以，引物肯定是过量的，但有时会不会出现特殊结构使引物更倾向于结合gDNA而导致cDNA扩增量不足。

我师兄也是这样说，怕有DNA污染或影响cDNA扩增，刚合了引物，做一下试试看吧，谢谢~
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千磨万击还坚劲，任尔东西南北风
3楼2014-01-13 22:36:36
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