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小孽博士

新虫 (小有名气)

[求助] 半定量PCR内参 已有2人参与

做半定量PCR,提RNA反转录成cDNA后扩actin,带非常亮。扩目的基因带时有两条带,经比对后鉴定大的那条是基因组带,小的那条是cDNA带,大小吻合,说明提RNA过程中有DNA未消化干净,cDNA中混有DNA污染。鉴于样本比较多,重新提RNA较麻烦,想了一个办法,请各位虫友帮忙看是否可行。本实验室所用内参为actin2,想在设计actin引物时设计两条跨内含子的引物,j基因组带比cDNA带要长将近200bp, 这样扩actin 的时候就会有两条带,一条基因组带,一条cDNA带。然后我只将cDNA带的亮度调一致,可以认为这就是总cDNA的内参吗?大家觉得可以吗?
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千磨万击还坚劲,任尔东西南北风
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小孽博士

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by lvbobo823 at 2014-01-13 21:51:02
我觉得可以,引物肯定是过量的,但有时会不会出现特殊结构使引物更倾向于结合gDNA而导致cDNA扩增量不足。

我师兄也是这样说,怕有DNA污染或影响cDNA扩增,刚合了引物,做一下试试看吧,谢谢~
千磨万击还坚劲,任尔东西南北风
3楼2014-01-13 22:36:36
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小孽博士: 金币+5, ★有帮助 2014-02-19 20:16:23
我觉得可以,引物肯定是过量的,但有时会不会出现特殊结构使引物更倾向于结合gDNA而导致cDNA扩增量不足。
hehe
2楼2014-01-13 21:51:02
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小孽博士: 金币+5, ★有帮助 2014-02-19 20:16:09
不建议这么做。因为当有不同模板竞争引物时,扩增效率可能会降低,会影响定量结果。你可以把为消化干净gDNAd的RNA重新消化,再做反转录。
4楼2014-01-13 23:58:58
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