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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切 连接
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浅笑包包

新虫 (小有名气)

[求助] 双酶切 连接 已有3人参与

最近在做目的基因与载体的连接实验，已经验证目的基因和载体的双酶切是成功的，我的载体有10000多bp,比较大，目的基因大概2000bp以内，做了一个月也没有连接上去，我想请问我的连接体系怎么设置比较好，也就是载体和目的基因的比例设置多大？以前做过载体：目的基因6：1，没有成功，今天准备试一试10:1，我是不是应该把比例调大点的方向来做梯度连接呢？？求指教。
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1楼 2013-12-24 15:38:33
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2013-12-24 17:02:53
我不清楚是不是你说反了，连接体系通常目的片段的摩尔浓度要比载体的高。载体：目的片段的范围可以从1:2至1:10。我觉得2kb的片段应该不算难连。你用的是16°C连过夜？因为片段比较大，可以适当提高连接温度。
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2楼2013-12-24 15:59:30
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浅笑包包

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-24 15:59:30
我不清楚是不是你说反了，连接体系通常目的片段的摩尔浓度要比载体的高。载体：目的片段的范围可以从1:2至1:10。我觉得2kb的片段应该不算难连。你用的是16°C连过夜？因为片段比较大，可以适当提高连接温度。

是的 ，写反了，我用的是16度过夜，提高温度？22度吗？
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3楼2013-12-24 16:01:41
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muyouleya

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2013-12-24 17:03:05
换种连接酶试试吧
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4楼2013-12-24 16:17:40
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woshishui916

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-12-25 12:15:29
不需要你们高的比例的哦
浓度上5：1
就差不多了
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5楼2013-12-24 18:15:56
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 浅笑包包 at 2013-12-24 16:01:41
是的 ，写反了，我用的是16度过夜，提高温度？22度吗？...

可以提高到20°C左右。
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6楼2013-12-25 06:39:12
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