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262734003

新虫 (初入文坛)

[求助] 质粒连接问题

我是新手,,最近在做质粒连接 用的是pGl3p做载体,用fse1+xba1双酶切,做了去磷酸化,然后测其浓度只有200ng/ul,我的目的片段只有40bp,做连接的步骤如下
fragment 10ul
vector 2ul
T4ligase 1.5ul
buffer 1.5ul
16℃ 过夜,做转化,但总是做不出,,,求高手指点,,谢谢大家!!
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262734003

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-04 15:43:17
载体用太多了,载体用量在50-100ng,连接片段很小,肯定不好连,建议降低温度,小片段用量增加,摩尔比用10:1。

还有你说的降低温度具体是指降低哪个温度??不太明白啊!!
7楼2013-12-04 18:07:54
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yang0071

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流! 2013-12-04 17:48:21
262734003: 金币+1, 有帮助 2013-12-05 19:04:21
总体系多少ul
放在冰箱4度过夜吧
或者放在pcr仪器里16度过夜
2楼2013-12-04 15:13:04
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-12-04 18:21:30
262734003: 金币+2 2013-12-05 19:04:38
载体用太多了,载体用量在50-100ng,连接片段很小,肯定不好连,建议降低温度,小片段用量增加,摩尔比用10:1。
3楼2013-12-04 15:43:17
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262734003

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by yang0071 at 2013-12-04 15:13:04
总体系多少ul
放在冰箱4度过夜吧
或者放在pcr仪器里16度过夜

15ul体系,我直接就是在PCR里16度过夜 第二天拿出直接做转化,,这样是不是会出现问题???
4楼2013-12-04 15:46:45
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