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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 质粒的连接与转化
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crazymouse66

金虫 (正式写手)

[求助] 质粒的连接与转化

大家好，我用一株细菌做完菌液PCR后跑琼脂糖电泳，跑完后做切胶回收，用的是试剂盒（试剂盒稍微有点过期了，但是回收完后我测了下DNA浓度和纯度，还是挺好的），然后再和PMD18T质粒进行质粒连接，连接用了一个晚上，是16度和4度交替连接，然后导入大肠杆菌感受态细胞中，最后涂板，用的是AMP氨苄平板，37度培养。但是现在的情况是：我连着做了两次，到最后平板上都没有菌落长出来，请问这大概是什么情况呢？是不是直接做的菌液PCR不能这样做啊？是否哪一步出现了问题，请大家指点一下。谢谢。
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1楼 2013-05-28 08:51:19
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yangtianyuan

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhang8826857: 金币+1, 鼓励回帖应助 2013-05-28 17:12:05
crazymouse66: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢你们提供的建议，谢谢 2013-06-14 19:18:13
有两种情况：一种是你的质粒有问题，你在确认一下。第二种情况就是你的大肠感受态不知道有没有问题，建议你换个感受态，还有最好就是用新一点的胶回收试剂盒！
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2楼2013-05-28 11:53:33
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sweetoath

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
crazymouse66: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢你们提供的建议，谢谢 2013-06-14 19:18:32
PCR的Taq酶是否具有加A功能？
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3楼2013-05-28 16:31:04
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crazymouse66

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by sweetoath at 2013-05-28 16:31:04
PCR的Taq酶是否具有加A功能？

没有加A功能的。
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4楼2013-05-28 19:51:20
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crazymouse66

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yangtianyuan at 2013-05-28 11:53:33
有两种情况：一种是你的质粒有问题，你在确认一下。第二种情况就是你的大肠感受态不知道有没有问题，建议你换个感受态，还有最好就是用新一点的胶回收试剂盒！

我们的质粒的话是这学期刚买的。其实对于这个我也有怀疑，因为无论怎样，假阳性的细菌总该长出来几个吧，可是连假阳性的菌也没长。这两次我都用的是别人实验室的感受态细胞，据说是挺好的，所以就直接拿来用了。这次我也在自己做感受态细胞，做完后再试一次吧。
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5楼2013-05-28 19:55:26
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sweetoath

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
crazymouse66: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢你的建议 2013-07-09 08:42:29
引用回帖:
4楼: Originally posted by crazymouse66 at 2013-05-28 19:51:20
没有加A功能的。...

如果你用的是高保真酶，
PCR产物片段末端是没有A碱基的，需要用普通Taq酶 72度加A后再与T载体连接，T载体的连接转化效率还是蛮高的。
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6楼2013-05-29 07:48:24
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skywards

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
crazymouse66: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢你们提供的建议，谢谢 2013-06-14 19:19:00
crazymouse66: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢 2013-07-09 08:42:41
应该做个对照，连接试剂盒里有质粒的，这样确保你用的东西没问题。另外，如果插入片段较小，普通Taq酶也可以的，做几个复孔可以筛到的。
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7楼2013-05-29 08:50:57
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yc652090251

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
crazymouse66: 金币+5, ★★★很有帮助, 真的十分感谢，谢谢你的帮助。 2013-06-14 19:19:33
crazymouse66: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢 2013-07-09 08:42:53
T载体是TA克隆专用载体，你PCR用的酶要是不能在PCR产物的3‘端添加一个A的话是无法和T载体连接上的，而且你的感受态的效率要验证一下，看看转化实验室的已知质粒是否能转进去。
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低调做人好么~~
8楼2013-05-29 22:40:32
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