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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 质粒的连接与转化
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crazymouse66

金虫 (正式写手)

[求助] 质粒的连接与转化

大家好，我用一株细菌做完菌液PCR后跑琼脂糖电泳，跑完后做切胶回收，用的是试剂盒（试剂盒稍微有点过期了，但是回收完后我测了下DNA浓度和纯度，还是挺好的），然后再和PMD18T质粒进行质粒连接，连接用了一个晚上，是16度和4度交替连接，然后导入大肠杆菌感受态细胞中，最后涂板，用的是AMP氨苄平板，37度培养。但是现在的情况是：我连着做了两次，到最后平板上都没有菌落长出来，请问这大概是什么情况呢？是不是直接做的菌液PCR不能这样做啊？是否哪一步出现了问题，请大家指点一下。谢谢。
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1楼 2013-05-28 08:51:19
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sweetoath

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
crazymouse66: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢你的建议 2013-07-09 08:42:29
引用回帖:
4楼: Originally posted by crazymouse66 at 2013-05-28 19:51:20
没有加A功能的。...

如果你用的是高保真酶，
PCR产物片段末端是没有A碱基的，需要用普通Taq酶 72度加A后再与T载体连接，T载体的连接转化效率还是蛮高的。
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6楼2013-05-29 07:48:24
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yangtianyuan

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhang8826857: 金币+1, 鼓励回帖应助 2013-05-28 17:12:05
crazymouse66: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢你们提供的建议，谢谢 2013-06-14 19:18:13
有两种情况：一种是你的质粒有问题，你在确认一下。第二种情况就是你的大肠感受态不知道有没有问题，建议你换个感受态，还有最好就是用新一点的胶回收试剂盒！
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2楼2013-05-28 11:53:33
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sweetoath

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
crazymouse66: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢你们提供的建议，谢谢 2013-06-14 19:18:32
PCR的Taq酶是否具有加A功能？
赞一下 回复此楼
3楼2013-05-28 16:31:04
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crazymouse66

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by sweetoath at 2013-05-28 16:31:04
PCR的Taq酶是否具有加A功能？

没有加A功能的。
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4楼2013-05-28 19:51:20
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