应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 质粒的连接与转化
81/1返回列表
查看: 1676  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

crazymouse66

金虫 (正式写手)

[求助] 质粒的连接与转化

大家好，我用一株细菌做完菌液PCR后跑琼脂糖电泳，跑完后做切胶回收，用的是试剂盒（试剂盒稍微有点过期了，但是回收完后我测了下DNA浓度和纯度，还是挺好的），然后再和PMD18T质粒进行质粒连接，连接用了一个晚上，是16度和4度交替连接，然后导入大肠杆菌感受态细胞中，最后涂板，用的是AMP氨苄平板，37度培养。但是现在的情况是：我连着做了两次，到最后平板上都没有菌落长出来，请问这大概是什么情况呢？是不是直接做的菌液PCR不能这样做啊？是否哪一步出现了问题，请大家指点一下。谢谢。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-05-28 08:51:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yangtianyuan

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhang8826857: 金币+1, 鼓励回帖应助 2013-05-28 17:12:05
crazymouse66: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢你们提供的建议，谢谢 2013-06-14 19:18:13
有两种情况：一种是你的质粒有问题，你在确认一下。第二种情况就是你的大肠感受态不知道有没有问题，建议你换个感受态，还有最好就是用新一点的胶回收试剂盒！
赞一下 回复此楼
2楼2013-05-28 11:53:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sweetoath

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
crazymouse66: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢你们提供的建议，谢谢 2013-06-14 19:18:32
PCR的Taq酶是否具有加A功能？
赞一下 回复此楼
3楼2013-05-28 16:31:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

crazymouse66

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by sweetoath at 2013-05-28 16:31:04
PCR的Taq酶是否具有加A功能？

没有加A功能的。
回复此楼
4楼2013-05-28 19:51:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

crazymouse66

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yangtianyuan at 2013-05-28 11:53:33
有两种情况：一种是你的质粒有问题，你在确认一下。第二种情况就是你的大肠感受态不知道有没有问题，建议你换个感受态，还有最好就是用新一点的胶回收试剂盒！

我们的质粒的话是这学期刚买的。其实对于这个我也有怀疑，因为无论怎样，假阳性的细菌总该长出来几个吧，可是连假阳性的菌也没长。这两次我都用的是别人实验室的感受态细胞，据说是挺好的，所以就直接拿来用了。这次我也在自己做感受态细胞，做完后再试一次吧。
赞一下 回复此楼
5楼2013-05-28 19:55:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sweetoath

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
crazymouse66: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢你的建议 2013-07-09 08:42:29
引用回帖:
4楼: Originally posted by crazymouse66 at 2013-05-28 19:51:20
没有加A功能的。...

如果你用的是高保真酶，
PCR产物片段末端是没有A碱基的，需要用普通Taq酶 72度加A后再与T载体连接，T载体的连接转化效率还是蛮高的。
赞一下 回复此楼
6楼2013-05-29 07:48:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

skywards

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
crazymouse66: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢你们提供的建议，谢谢 2013-06-14 19:19:00
crazymouse66: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢 2013-07-09 08:42:41
应该做个对照，连接试剂盒里有质粒的，这样确保你用的东西没问题。另外，如果插入片段较小，普通Taq酶也可以的，做几个复孔可以筛到的。
赞一下 回复此楼
7楼2013-05-29 08:50:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yc652090251

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
crazymouse66: 金币+5, ★★★很有帮助, 真的十分感谢，谢谢你的帮助。 2013-06-14 19:19:33
crazymouse66: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢 2013-07-09 08:42:53
T载体是TA克隆专用载体，你PCR用的酶要是不能在PCR产物的3‘端添加一个A的话是无法和T载体连接上的，而且你的感受态的效率要验证一下，看看转化实验室的已知质粒是否能转进去。
赞一下 回复此楼
低调做人好么~~
8楼2013-05-29 22:40:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 crazymouse66 的主题更新
81/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考博] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 4/200 2026-08-30 01:58 by ZPa0EcMwuECS
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 3/150 2026-08-30 01:58 by ZPa0EcMwuECS
[博后之家] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 6/300 2026-08-30 01:47 by ZPa0EcMwuECS
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +4 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 4/200 2026-08-30 01:45 by ZPa0EcMwuECS
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +4 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 7/350 2026-08-30 01:36 by ZPa0EcMwuECS
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +6 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 9/450 2026-08-30 01:04 by ZPa0EcMwuECS
[论文投稿] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +4 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 5/250 2026-08-30 01:03 by ZPa0EcMwuECS
[找工作] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 7/350 2026-08-30 00:52 by ZPa0EcMwuECS
[基金申请] 中青基了要发朋友圈吗？ +4 349506619 2026-08-28 4/200 2026-08-29 22:41 by alongwaytogo
[基金申请] 国自然面上复盘~欢迎讨论 (金币+15) +15 晴天加油 2026-08-26 16/800 2026-08-29 18:28 by symmetry
[基金申请] 有没有仍没收到信息的 +5 德尚中行 2026-08-27 6/300 2026-08-29 18:10 by manplx
[教师之家] 导师吐槽：我怎么摊上了这么个极品研究生！ +9 苏东坡二世 2026-08-23 9/450 2026-08-29 14:41 by hustersqt
[基金申请] 国自然评审意见 +13 wangmingqi 2026-08-28 19/950 2026-08-29 10:22 by Poppy1104
[基金申请] 2026年叶企孙基金 +4 bud_bud 2026-08-27 7/350 2026-08-29 07:23 by foolishmani
[基金申请] 为什么资助数各大高校都创新高，自己申请怎么就这么难 +12 Kittylucky 2026-08-27 13/650 2026-08-29 00:04 by superceng
[基金申请] 看板上这么多中的，有点像50人群里49个人都是骗子的那种感觉…… +5 a089 2026-08-26 6/300 2026-08-27 14:05 by jonewore
[基金申请] 我不理解！ +15 Edward_pc 2026-08-26 23/1150 2026-08-26 20:34 by zzuzxg
[基金申请] 国合里面能看到了 +7 一怀馨秋 2026-08-26 7/350 2026-08-26 11:23 by zhaosm1982
[基金申请] 国际合作可查了，中了面上 (EPI+1)(金币+50) +18 Ldrop2023 2026-08-26 18/900 2026-08-26 11:15 by cmrandy
[基金申请] 项目信息和经费信息在系统里都可以看到了 +6 wittyboy 2026-08-26 14/700 2026-08-26 10:55 by wittyboy
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭