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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒连接问题
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262734003

新虫 (初入文坛)

[求助] 质粒连接问题

我是新手，，最近在做质粒连接 用的是pGl3p做载体，用fse1+xba1双酶切，做了去磷酸化，然后测其浓度只有200ng/ul，我的目的片段只有40bp，做连接的步骤如下
fragment 10ul
vector 2ul
T4ligase 1.5ul
buffer 1.5ul
16℃ 过夜，做转化，但总是做不出，，，求高手指点，，谢谢大家！！
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1楼 2013-12-04 15:06:35
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yang0071

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流！ 2013-12-04 17:48:21
262734003: 金币+1, ★有帮助 2013-12-05 19:04:21
总体系多少ul
放在冰箱4度过夜吧
或者放在pcr仪器里16度过夜
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2楼2013-12-04 15:13:04
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-04 18:21:30
262734003: 金币+2 2013-12-05 19:04:38
载体用太多了，载体用量在50-100ng，连接片段很小，肯定不好连，建议降低温度，小片段用量增加，摩尔比用10:1。
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3楼2013-12-04 15:43:17
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262734003

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yang0071 at 2013-12-04 15:13:04
总体系多少ul
放在冰箱4度过夜吧
或者放在pcr仪器里16度过夜

15ul体系，我直接就是在PCR里16度过夜 第二天拿出直接做转化，，这样是不是会出现问题？？？
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4楼2013-12-04 15:46:45
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262734003

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-04 15:43:17
载体用太多了，载体用量在50-100ng，连接片段很小，肯定不好连，建议降低温度，小片段用量增加，摩尔比用10:1。

我的片段浓度很大，，有850ng/ul，，，应该比例是多少？？谢谢
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5楼2013-12-04 15:47:49
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262734003

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-04 15:43:17
载体用太多了，载体用量在50-100ng，连接片段很小，肯定不好连，建议降低温度，小片段用量增加，摩尔比用10:1。

请问，连接时要看目的基因的浓度嘛  摩尔比10:1 具体换算成体积比应该是多少啊？？谢谢
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6楼2013-12-04 18:05:52
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262734003

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-04 15:43:17
载体用太多了，载体用量在50-100ng，连接片段很小，肯定不好连，建议降低温度，小片段用量增加，摩尔比用10:1。

还有你说的降低温度具体是指降低哪个温度？？不太明白啊！！
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7楼2013-12-04 18:07:54
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