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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于WB转膜的问题
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草鹿八千留

银虫 (初入文坛)

[求助] 关于WB转膜的问题 已有1人参与

小女最近在做western blot，刚开始做，很多东西还不懂。
       遇到一个很奇怪的问题，GST蛋白pulldown实验，被拉的蛋白是his标签，然后用anti-his的一抗来做western实验。两个蛋白均是体外纯化的，是因为怕拉到的蛋白量少，用考马斯亮蓝染色条带太弱，所以才想采用western来放大一下信号。
       但是我在做western的同时也跑了一块胶来做考马斯亮蓝染色，发现可以看到很弱的条带。可是western做了两遍还是看不到理论该有的条带，后来把膜用丽春红染色，发现能看到很明显的GST蛋白（35kd）的条带，可是却看不到被拉的蛋白（16kd）的条带。
       确定一抗和二抗都没有问题。苦思不得其解，哪位western高手能够帮我解答一下，不胜感激！！
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1楼 2013-11-28 17:37:52
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Lovebirdshs

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-28 20:06:15
His蛋白相互作用研究不建议使用抗体IP，应该是这个样子的后继操作比较方便：Ni-beats+protein-6*His+interaction-protein，孵育结合后直接变性进行SDS-PAGE及western blot检测，一抗选择同源的不同抗体（如都是鼠或者兔源的），二抗只加一种（羊抗鼠或兔）就OK了，为了区别抗体与蛋白间的交叉反应设置相应对照就可以了，可以一次完成检测。
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孤独的舞者
2楼2013-11-28 18:45:23
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Lovebirdshs

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
2楼: Originally posted by Lovebirdshs at 2013-11-28 18:45:23
His蛋白相互作用研究不建议使用抗体IP，应该是这个样子的后继操作比较方便：Ni-beats+protein-6*His+interaction-protein，孵育结合后直接变性进行SDS-PAGE及western blot检测，一抗选择同源的不同抗体（如都是鼠或 ...

没有检测到目的带说明可能体外无相互作用或者作用太弱或者洗脱强度相对大导致被洗掉，只剩诱饵蛋白  呵呵
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孤独的舞者
3楼2013-11-28 18:49:15
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

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“但是我在做western的同时也跑了一块胶来做考马斯亮蓝染色，发现可以看到很弱的条带。”
------这条带是GST带还是His带？

“后来把膜用丽春红染色，发现能看到很明显的GST蛋白（35kd）的条带，可是却看不到被拉的蛋白（16kd）的条带。”
--------这不正解释了你为什么检测不到His，说明你的GST-蛋白跟His-蛋白没有自己相互作用，或者相互作用很弱
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
4楼2013-11-28 20:10:31
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草鹿八千留

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by gyesang at 2013-11-28 20:10:31
“但是我在做western的同时也跑了一块胶来做考马斯亮蓝染色，发现可以看到很弱的条带。”
------这条带是GST带还是His带？

“后来把膜用丽春红染色，发现能看到很明显的GST蛋白（35kd）的条带，可是却看不到被 ...

考马斯亮蓝检测出了带his的蛋白，并且这两个蛋白之间的相互作用已经是确定有的。并且western中his蛋白的input也跑了，都没有杂出来。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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5楼2013-11-28 22:29:11
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草鹿八千留

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Lovebirdshs at 2013-11-28 18:49:15
没有检测到目的带说明可能体外无相互作用或者作用太弱或者洗脱强度相对大导致被洗掉，只剩诱饵蛋白  呵呵...

其实我现在遇到的主要问题不是检测这两个蛋白之间是否有相互作用，这个相互作用已经用若干方法确定是肯定有的。主要的问题是western杂不出条带来，丽春红染色能看到分子量大小差不多的转上膜了而并没有看到我自己的条带，也就是说转膜会不会只有一部分转上？还是说，丽春红有些蛋白是染不上色的？
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6楼2013-11-28 22:45:45
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guoyingnba

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-27 15:05:47
你要是确定his抗体没问题，那就是带his的蛋白用这个抗体检测不到。我也遇到过这种情况，后来改用抗蛋白的一抗就能做出来，但是用his就是砸不出来。可能是这个蛋白带了his tag以后有些问题，导致用his抗体砸不出来。
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7楼2013-11-29 21:59:14
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草鹿八千留

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by guoyingnba at 2013-11-29 21:59:14
你要是确定his抗体没问题，那就是带his的蛋白用这个抗体检测不到。我也遇到过这种情况，后来改用抗蛋白的一抗就能做出来，但是用his就是砸不出来。可能是这个蛋白带了his tag以后有些问题，导致用his抗体砸不出来。

这个蛋白以前用his抗体是能杂出来的，不过我现在也在怀疑是抗体的问题，谢谢了。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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8楼2013-11-30 00:56:52
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

可能没有His标记的那个蛋白，胶染色看到的是某种杂蛋白
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9楼2013-12-27 10:51:56
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20081118129

新虫 (著名写手)

Drake
您好！我也正在做GST-pull down实验，第一次做，什么也不懂，你可以把实验步骤和需要的Buffer给我发一下吗？？谢谢。还有带His标签的蛋白纯化的步骤！非常感谢！！！
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10楼2016-05-26 19:07:32
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