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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » WB问题请教，请高手指点
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lipingzhou

银虫 (初入文坛)

[求助] WB问题请教，请高手指点

本人最近一直在做WB，只有内参β-actin有结果，其他蛋白均没有结果，像各位高手求助啊，我将实验信息写在下面，请诸位大神指点一二：
1.我的蛋白分子量分别是93,43,11；
2.我转膜的条件是半干法0.04mA，一个小时；
3.转膜后丽春红染色有许多条带；
4.5%脱脂奶粉封闭2h；
5.我的一抗是abcam的，用5%封闭液稀释（1:1000；1:2000按抗体说明书操作）；
6.TBST洗膜10min*3；
7.二抗也是abcam的，1:5000；
8.加ECL后暗室中看不到荧光（内参也看不到荧光但内参显影定影后有较好的条带）；
9.曝光20s，以前曝光1min是背景全黑了，内参压片20s后条带较好了，但是别的蛋白压片从20s到1min都没有条带，前几次显影定影都会有背景（尽管没有条带），但最近一次连背景都没有了，一片透明，会是什么原因呢？？？

每一张PVDF膜转膜后我都会丽春红染色，发现都有条带的，就是加ECL后暗室里看不到荧光，急死了，都一个月了还做不出来，给位帮帮忙啊，万分感谢！！！
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1楼 2013-06-26 10:24:26
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

zhaoxr0311

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
137167741: 金币+2, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-06-26 18:27:33
个人感觉你的转膜有些问题，我们实验室一般是2mA/cm2，根据胶的大小应该在50mA左右，转一个小时，然后90多kD，建议延长20分钟；还有11kD你可以确保没有跑出去吗？11kD就要求转膜的时间相对调短，以免转过
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4楼2013-06-26 14:33:54
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zhaoxr0311

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by lipingzhou at 2013-06-26 14:59:27
谢谢您的建议，请问11kd的怎么看有没有跑过？是电泳时间太久？还是什么意思？请再指点一下...

是的，11kD太小了时间长了就容易跑出去，最好用小分子胶跑，带个在11kD附件的Marker就可以了
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8楼2013-06-26 15:32:01
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晴天1882

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by lipingzhou at 2013-06-26 14:56:11
我上样量有40ug，压片过夜直接室温放着吗？我的内参我只压了20s，过夜的话会不会就时间太久没有荧光呢？...

过夜最后荧光肯定没有了，但你胶片过夜压都没有条带的话问题就有太多可能了，内参量比较大啊！二十秒就好了，目的蛋白你只压了一分钟没有条带，你可以再压个三十分钟试试，一分钟有点短吧！
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人有绝交，才有至交！
10楼2013-06-26 21:11:24
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晴天1882

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-06-26 12:27:27
过程没太大问题，毕竟内参能做出来，我都是用湿转，会不会是你要做的蛋白量较少？之前测过蛋白浓度没？要不你胶片压过夜试试？
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人有绝交，才有至交！
2楼2013-06-26 11:42:38
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果没有什么背景，可以延长暴光时间。我做过一个蛋白，需要暴20分钟才出东西的。如果你在暗室里用肉眼可以看到发荧光，说明信号太强了，暴光出来的带型效果反而不好。一般western好的结果一般是暴光稍微长一些的，比如30s-5分钟。能做出内参说明操作上大致没有问题。目的蛋白可能丰度低或者抗体的效价不高，可能需要调整上样量或者一抗的稀释倍数。
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3楼2013-06-26 14:22:59
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lipingzhou

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 晴天1882 at 2013-06-26 11:42:38
过程没太大问题，毕竟内参能做出来，我都是用湿转，会不会是你要做的蛋白量较少？之前测过蛋白浓度没？要不你胶片压过夜试试？

我上样量有40ug，压片过夜直接室温放着吗？我的内参我只压了20s，过夜的话会不会就时间太久没有荧光呢？
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5楼2013-06-26 14:56:11
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lipingzhou

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-06-26 14:22:59
如果没有什么背景，可以延长暴光时间。我做过一个蛋白，需要暴20分钟才出东西的。如果你在暗室里用肉眼可以看到发荧光，说明信号太强了，暴光出来的带型效果反而不好。一般western好的结果一般是暴光稍微长一些的， ...

谢谢，意思是内参压片的时间不能作为其他蛋白压片时间的一个参照对吧？
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6楼2013-06-26 14:57:53
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lipingzhou

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zhaoxr0311 at 2013-06-26 14:33:54
个人感觉你的转膜有些问题，我们实验室一般是2mA/cm2，根据胶的大小应该在50mA左右，转一个小时，然后90多kD，建议延长20分钟；还有11kD你可以确保没有跑出去吗？11kD就要求转膜的时间相对调短，以免转过

谢谢您的建议，请问11kd的怎么看有没有跑过？是电泳时间太久？还是什么意思？请再指点一下
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7楼2013-06-26 14:59:27
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zhaoxr0311

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by lipingzhou at 2013-06-26 14:56:11
我上样量有40ug，压片过夜直接室温放着吗？我的内参我只压了20s，过夜的话会不会就时间太久没有荧光呢？...

过夜肯定会猝灭的
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9楼2013-06-26 15:33:08
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