应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于WB转膜的问题
51/1返回列表
查看: 2912  |  回复: 9
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

草鹿八千留

银虫 (初入文坛)

[求助] 关于WB转膜的问题 已有1人参与

小女最近在做western blot，刚开始做，很多东西还不懂。
       遇到一个很奇怪的问题，GST蛋白pulldown实验，被拉的蛋白是his标签，然后用anti-his的一抗来做western实验。两个蛋白均是体外纯化的，是因为怕拉到的蛋白量少，用考马斯亮蓝染色条带太弱，所以才想采用western来放大一下信号。
       但是我在做western的同时也跑了一块胶来做考马斯亮蓝染色，发现可以看到很弱的条带。可是western做了两遍还是看不到理论该有的条带，后来把膜用丽春红染色，发现能看到很明显的GST蛋白（35kd）的条带，可是却看不到被拉的蛋白（16kd）的条带。
       确定一抗和二抗都没有问题。苦思不得其解，哪位western高手能够帮我解答一下，不胜感激！！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-11-28 17:37:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

草鹿八千留

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Lovebirdshs at 2013-11-28 18:49:15
没有检测到目的带说明可能体外无相互作用或者作用太弱或者洗脱强度相对大导致被洗掉，只剩诱饵蛋白  呵呵...

其实我现在遇到的主要问题不是检测这两个蛋白之间是否有相互作用，这个相互作用已经用若干方法确定是肯定有的。主要的问题是western杂不出条带来，丽春红染色能看到分子量大小差不多的转上膜了而并没有看到我自己的条带，也就是说转膜会不会只有一部分转上？还是说，丽春红有些蛋白是染不上色的？
赞一下 回复此楼
6楼2013-11-28 22:45:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 10 个回答

Lovebirdshs

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-28 20:06:15
His蛋白相互作用研究不建议使用抗体IP，应该是这个样子的后继操作比较方便：Ni-beats+protein-6*His+interaction-protein，孵育结合后直接变性进行SDS-PAGE及western blot检测，一抗选择同源的不同抗体（如都是鼠或者兔源的），二抗只加一种（羊抗鼠或兔）就OK了，为了区别抗体与蛋白间的交叉反应设置相应对照就可以了，可以一次完成检测。
赞一下 回复此楼
孤独的舞者
2楼2013-11-28 18:45:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Lovebirdshs

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
2楼: Originally posted by Lovebirdshs at 2013-11-28 18:45:23
His蛋白相互作用研究不建议使用抗体IP，应该是这个样子的后继操作比较方便：Ni-beats+protein-6*His+interaction-protein，孵育结合后直接变性进行SDS-PAGE及western blot检测，一抗选择同源的不同抗体（如都是鼠或 ...

没有检测到目的带说明可能体外无相互作用或者作用太弱或者洗脱强度相对大导致被洗掉，只剩诱饵蛋白  呵呵
赞一下 回复此楼
孤独的舞者
3楼2013-11-28 18:49:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
“但是我在做western的同时也跑了一块胶来做考马斯亮蓝染色，发现可以看到很弱的条带。”
------这条带是GST带还是His带？

“后来把膜用丽春红染色，发现能看到很明显的GST蛋白（35kd）的条带，可是却看不到被拉的蛋白（16kd）的条带。”
--------这不正解释了你为什么检测不到His，说明你的GST-蛋白跟His-蛋白没有自己相互作用，或者相互作用很弱
赞一下 回复此楼
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
4楼2013-11-28 20:10:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 10 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭