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有关重叠PCR的问题，请各位讲解一下已有5人参与
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| 大家好，我现在在做一个重叠PCR的实验，我要连接的三个片段X、Cm（氯霉素片段）、Y均750bp，我先通过正常的PCR技术获得X、Cm（氯霉素片段）、Y条带，然后尝试先重叠X、Cm，得到XC之后再连Y的时候怎么也连不上，请问为什么？我是新手，请指点一下有关重叠PCR当中需要注意的地方，谢谢！ |
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2楼2013-11-22 23:16:25
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3楼2013-11-23 01:21:00
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6楼2013-11-24 13:46:30
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我也是正要做重叠PCR，做第一步搭接反应，在网上查到一些方案（12个引物片段），说每条引物加1ul，PCR65℃ 5cycle，60℃ 5cycle。而我在小木虫上下了一篇文章PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences，引物的量加的极少，F01、R01各1ul,中间的引物（10条，引物浓度30pmol）各取1ul混合，混合后取0.5ul与F01、R01混在一起作为引物,PCR 58℃ 27cycle，还72℃延伸10min 。这两个方法完全没有相关性。 版主能够给一个推荐反应条件吗？ 另外想问，引物加多少合适?英文的文献引物的浓度会不会太低？ 退货温度根据什么定的？60℃左右会不会特异性太强P不出东西？ 望指点。 |
7楼2014-01-08 23:41:53
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