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24K_纯虹

铁虫 (初入文坛)

[交流] 有关重叠PCR的问题，请各位讲解一下 已有5人参与

大家好，我现在在做一个重叠PCR的实验，我要连接的三个片段X、Cm（氯霉素片段）、Y均750bp，我先通过正常的PCR技术获得X、Cm（氯霉素片段）、Y条带，然后尝试先重叠X、Cm，得到XC之后再连Y的时候怎么也连不上，请问为什么？我是新手，请指点一下有关重叠PCR当中需要注意的地方，谢谢！
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镖跟靶的每次分离，都是为了再一次重回把心，所以，等待。。。
1楼 2013-11-22 22:12:39
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sun_in_night

木虫 (小有名气)
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gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-23 01:20:11
推荐看一下这篇文章Gene splicing and mutagenesis by PCR-driven overlap extension. Karin L Heckman & Larry R Pease，2007，nature protocols
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2楼2013-11-22 23:16:25
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼主可以看下这个帖子：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=5257232&pid=2#pid2
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3楼2013-11-23 01:21:00
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Fleaves

至尊木虫 (著名写手)
没做过，不知道

[ 发自小木虫客户端 ]
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4楼2013-11-23 04:12:12
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24K_纯虹

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sun_in_night at 2013-11-22 23:16:25
推荐看一下这篇文章Gene splicing and mutagenesis by PCR-driven overlap extension. Karin L Heckman & Larry R Pease，2007，nature protocols

谢谢你
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镖跟靶的每次分离，都是为了再一次重回把心，所以，等待。。。
5楼2013-11-23 22:10:10
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nannanz2012

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
最后一片断进行重叠引物的扩增没？XC怎么得到的，然后cxy就按原先的程序走呀，大同小异。祝好运
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6楼2013-11-24 13:46:30
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lingbi

银虫 (正式写手)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by gyesang at 2013-11-23 01:21:00
楼主可以看下这个帖子：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=5257232&pid=2#pid2

我也是正要做重叠PCR，做第一步搭接反应，在网上查到一些方案（12个引物片段），说每条引物加1ul，PCR65℃ 5cycle，60℃ 5cycle。而我在小木虫上下了一篇文章PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences，引物的量加的极少，F01、R01各1ul,中间的引物（10条，引物浓度30pmol）各取1ul混合，混合后取0.5ul与F01、R01混在一起作为引物,PCR 58℃ 27cycle，还72℃延伸10min 。这两个方法完全没有相关性。
版主能够给一个推荐反应条件吗？

另外想问，引物加多少合适?英文的文献引物的浓度会不会太低？
退货温度根据什么定的？60℃左右会不会特异性太强P不出东西？
望指点。
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7楼2014-01-08 23:41:53
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gyesang

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7楼: Originally posted by lingbi at 2014-01-08 23:41:53
我也是正要做重叠PCR，做第一步搭接反应，在网上查到一些方案（12个引物片段），说每条引物加1ul，PCR65℃ 5cycle，60℃ 5cycle。而我在小木虫上下了一篇文章PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences， ...

这个没有统一的标准，实在不确定你就先试，只要能出结果的方法都是好方法，我一般做的没有那么严格，就跟普通PCR一样，只是模板加两个片段，你先做，等做不出来再说
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
8楼2014-01-09 11:21:02
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lingbi

银虫 (正式写手)
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8楼: Originally posted by gyesang at 2014-01-09 11:21:02
这个没有统一的标准，实在不确定你就先试，只要能出结果的方法都是好方法，我一般做的没有那么严格，就跟普通PCR一样，只是模板加两个片段，你先做，等做不出来再说...

两个片段搭接合成一个的我大概知道怎么做，就是合成十几条引物合成一个基因的有点弄不清，以前也做过师姐给的条件没多想就套用了，现在回想为什么这么设置就想不清了，最近不做这个只好等有机会再试了。就是突然想到这个问题了，它的退货温度是不是比普通PCR要高这样可以减少非特异条带？引物加量是不是处于整个基因中间位置的浓度低些？是不是比普通的PCR要多注意些呢
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9楼2014-01-09 22:55:31
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