应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 有关重叠PCR的问题，请各位讲解一下
91/1返回列表
查看: 1651  |  回复: 8
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

24K_纯虹

铁虫 (初入文坛)

[交流] 有关重叠PCR的问题，请各位讲解一下 已有5人参与

大家好，我现在在做一个重叠PCR的实验，我要连接的三个片段X、Cm（氯霉素片段）、Y均750bp，我先通过正常的PCR技术获得X、Cm（氯霉素片段）、Y条带，然后尝试先重叠X、Cm，得到XC之后再连Y的时候怎么也连不上，请问为什么？我是新手，请指点一下有关重叠PCR当中需要注意的地方，谢谢！
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

分子生化实验经验积累

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
镖跟靶的每次分离，都是为了再一次重回把心，所以，等待。。。
1楼 2013-11-22 22:12:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sun_in_night

木虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-23 01:20:11
推荐看一下这篇文章Gene splicing and mutagenesis by PCR-driven overlap extension. Karin L Heckman & Larry R Pease，2007，nature protocols
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2013-11-22 23:16:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼主可以看下这个帖子：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=5257232&pid=2#pid2
赞一下(1人) 回复此楼
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
3楼2013-11-23 01:21:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Fleaves

至尊木虫 (著名写手)
没做过，不知道

[ 发自小木虫客户端 ]
回复此楼
4楼2013-11-23 04:12:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

24K_纯虹

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sun_in_night at 2013-11-22 23:16:25
推荐看一下这篇文章Gene splicing and mutagenesis by PCR-driven overlap extension. Karin L Heckman & Larry R Pease，2007，nature protocols

谢谢你
回复此楼
镖跟靶的每次分离，都是为了再一次重回把心，所以，等待。。。
5楼2013-11-23 22:10:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

nannanz2012

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
最后一片断进行重叠引物的扩增没？XC怎么得到的，然后cxy就按原先的程序走呀，大同小异。祝好运
赞一下 回复此楼
6楼2013-11-24 13:46:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lingbi

银虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by gyesang at 2013-11-23 01:21:00
楼主可以看下这个帖子：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=5257232&pid=2#pid2

我也是正要做重叠PCR，做第一步搭接反应，在网上查到一些方案（12个引物片段），说每条引物加1ul，PCR65℃ 5cycle，60℃ 5cycle。而我在小木虫上下了一篇文章PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences，引物的量加的极少，F01、R01各1ul,中间的引物（10条，引物浓度30pmol）各取1ul混合，混合后取0.5ul与F01、R01混在一起作为引物,PCR 58℃ 27cycle，还72℃延伸10min 。这两个方法完全没有相关性。
版主能够给一个推荐反应条件吗？

另外想问，引物加多少合适?英文的文献引物的浓度会不会太低？
退货温度根据什么定的？60℃左右会不会特异性太强P不出东西？
望指点。
赞一下 回复此楼
7楼2014-01-08 23:41:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
7楼: Originally posted by lingbi at 2014-01-08 23:41:53
我也是正要做重叠PCR，做第一步搭接反应，在网上查到一些方案（12个引物片段），说每条引物加1ul，PCR65℃ 5cycle，60℃ 5cycle。而我在小木虫上下了一篇文章PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences， ...

这个没有统一的标准，实在不确定你就先试，只要能出结果的方法都是好方法，我一般做的没有那么严格，就跟普通PCR一样，只是模板加两个片段，你先做，等做不出来再说
赞一下 回复此楼
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
8楼2014-01-09 11:21:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lingbi

银虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
8楼: Originally posted by gyesang at 2014-01-09 11:21:02
这个没有统一的标准，实在不确定你就先试，只要能出结果的方法都是好方法，我一般做的没有那么严格，就跟普通PCR一样，只是模板加两个片段，你先做，等做不出来再说...

两个片段搭接合成一个的我大概知道怎么做，就是合成十几条引物合成一个基因的有点弄不清，以前也做过师姐给的条件没多想就套用了，现在回想为什么这么设置就想不清了，最近不做这个只好等有机会再试了。就是突然想到这个问题了，它的退货温度是不是比普通PCR要高这样可以减少非特异条带？引物加量是不是处于整个基因中间位置的浓度低些？是不是比普通的PCR要多注意些呢
赞一下 回复此楼
9楼2014-01-09 22:55:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 24K_纯虹 的主题更新
91/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 085600材料与化工调剂 5+3 孜孜不倦2002 2026-04-19 6/300 2026-04-20 21:25 by babero
[考研] 320求调剂 +6 深郊akm 2026-04-17 6/300 2026-04-20 18:57 by fs26jie
[论文投稿] 有没有接收比较快的sci期刊呀，最好在一个月之内的，研三孩子求毕业 20+4 之护着 2026-04-16 7/350 2026-04-20 15:45 by 豆豆7758
[教师之家] 又一批高校组建人工智能学院 师资行吗 不是骗人吗 +4 yexuqing 2026-04-19 4/200 2026-04-20 14:47 by brantleo
[考研] 297，工科调剂?河南农业大学本科 +15 河南农业大学-能 2026-04-14 15/750 2026-04-20 12:39 by Equinoxhua
[考研] 337求调剂 +3 jyz04 2026-04-18 3/150 2026-04-20 12:24 by 研可安
[考博] 申博/考博 +4 啃面包的小书虫 2026-04-17 5/250 2026-04-20 10:47 by YuY66
[考博] 申博 +3 Xyyx. 2026-04-18 3/150 2026-04-20 10:44 by YuY66
[考研] 通信工程求调剂！！！ +7 zlb770521 2026-04-14 7/350 2026-04-19 20:56 by Equinoxhua
[考研] 297，工科调剂? +11 河南农业大学-能 2026-04-14 11/550 2026-04-19 20:07 by Equinoxhua
[考研] 291求调剂 +11 关忆北. 2026-04-14 11/550 2026-04-19 17:16 by 中豫男
[考研] 求调剂推荐 +9 小聂爱学习 2026-04-14 9/450 2026-04-19 17:03 by 中豫男
[考研] 300求调剂 +12 橙a777 2026-04-15 12/600 2026-04-18 23:51 by 路病情
[考研] 接受任何调剂 +6 也就是栗子 2026-04-17 7/350 2026-04-18 17:20 by 涵竹刘
[考研] 297，工科调剂? +5 河南农业大学-能 2026-04-14 5/250 2026-04-18 15:17 by Equinoxhua
[考研] 22408 312求调剂 +24 门路摸摸 2026-04-14 26/1300 2026-04-18 13:04 by wunaiy88
[考研] 急需调剂 +9 绝不放弃22 2026-04-15 10/500 2026-04-18 08:09 by chixmc
[考研] 一志愿华中农业071010，320求调剂 +17 困困困困坤坤 2026-04-14 19/950 2026-04-17 20:08 by 关一盏灯cd
[考研] 一志愿沪9，生物学326求调剂 +9 刘墨墨 2026-04-15 9/450 2026-04-16 17:14 by 崔崔崔cccc
[考研] 一志愿A区211，22408 321求调剂 +6 随心所欲☆ 2026-04-15 7/350 2026-04-15 21:45 by lbsjt
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭