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24K_纯虹

铁虫 (初入文坛)

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[交流] 有关重叠PCR的问题，请各位讲解一下已有5人参与

大家好，我现在在做一个重叠PCR的实验，我要连接的三个片段X、Cm（氯霉素片段）、Y均750bp，我先通过正常的PCR技术获得X、Cm（氯霉素片段）、Y条带，然后尝试先重叠X、Cm，得到XC之后再连Y的时候怎么也连不上，请问为什么？我是新手，请指点一下有关重叠PCR当中需要注意的地方，谢谢！

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镖跟靶的每次分离，都是为了再一次重回把心，所以，等待。。。

1楼 2013-11-22 22:12:39

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

lingbi

银虫 (正式写手)

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★
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引用回帖:

3楼: Originally posted by gyesang at 2013-11-23 01:21:00
楼主可以看下这个帖子：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=5257232&pid=2#pid2

我也是正要做重叠PCR，做第一步搭接反应，在网上查到一些方案（12个引物片段），说每条引物加1ul，PCR65℃ 5cycle，60℃ 5cycle。而我在小木虫上下了一篇文章PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences，引物的量加的极少，F01、R01各1ul,中间的引物（10条，引物浓度30pmol）各取1ul混合，混合后取0.5ul与F01、R01混在一起作为引物,PCR 58℃ 27cycle，还72℃延伸10min 。这两个方法完全没有相关性。
版主能够给一个推荐反应条件吗？

另外想问，引物加多少合适?英文的文献引物的浓度会不会太低？
退货温度根据什么定的？60℃左右会不会特异性太强P不出东西？
望指点。