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24K_纯虹

铁虫 (初入文坛)

[交流] 有关重叠PCR的问题,请各位讲解一下 已有5人参与

大家好,我现在在做一个重叠PCR的实验,我要连接的三个片段X、Cm(氯霉素片段)、Y均750bp,我先通过正常的PCR技术获得X、Cm(氯霉素片段)、Y条带,然后尝试先重叠X、Cm,得到XC之后再连Y的时候怎么也连不上,请问为什么?我是新手,请指点一下有关重叠PCR当中需要注意的地方,谢谢!
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镖跟靶的每次分离,都是为了再一次重回把心,所以,等待。。。
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lingbi

银虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
8楼: Originally posted by gyesang at 2014-01-09 11:21:02
这个没有统一的标准,实在不确定你就先试,只要能出结果的方法都是好方法,我一般做的没有那么严格,就跟普通PCR一样,只是模板加两个片段,你先做,等做不出来再说...

两个片段搭接合成一个的我大概知道怎么做,就是合成十几条引物合成一个基因的有点弄不清,以前也做过师姐给的条件没多想就套用了,现在回想为什么这么设置就想不清了,最近不做这个只好等有机会再试了。就是突然想到这个问题了,它的退货温度是不是比普通PCR要高这样可以减少非特异条带?引物加量是不是处于整个基因中间位置的浓度低些?是不是比普通的PCR要多注意些呢
9楼2014-01-09 22:55:31
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sun_in_night

木虫 (小有名气)

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-11-23 01:20:11
推荐看一下这篇文章Gene splicing and mutagenesis by PCR-driven overlap extension. Karin L Heckman & Larry R Pease,2007,nature protocols
2楼2013-11-22 23:16:25
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
3楼2013-11-23 01:21:00
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Fleaves

至尊木虫 (著名写手)

没做过,不知道

[ 发自小木虫客户端 ]
4楼2013-11-23 04:12:12
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