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24K_纯虹

铁虫 (初入文坛)

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虫号: 2654338
注册: 2013-09-14
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专业: 生物化学

[交流] 有关重叠PCR的问题，请各位讲解一下已有5人参与

大家好，我现在在做一个重叠PCR的实验，我要连接的三个片段X、Cm（氯霉素片段）、Y均750bp，我先通过正常的PCR技术获得X、Cm（氯霉素片段）、Y条带，然后尝试先重叠X、Cm，得到XC之后再连Y的时候怎么也连不上，请问为什么？我是新手，请指点一下有关重叠PCR当中需要注意的地方，谢谢！

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镖跟靶的每次分离，都是为了再一次重回把心，所以，等待。。。

1楼 2013-11-22 22:12:39

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lingbi

银虫 (正式写手)

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性别: MM
专业: 疫苗学

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引用回帖:

8楼: Originally posted by gyesang at 2014-01-09 11:21:02
这个没有统一的标准，实在不确定你就先试，只要能出结果的方法都是好方法，我一般做的没有那么严格，就跟普通PCR一样，只是模板加两个片段，你先做，等做不出来再说...

两个片段搭接合成一个的我大概知道怎么做，就是合成十几条引物合成一个基因的有点弄不清，以前也做过师姐给的条件没多想就套用了，现在回想为什么这么设置就想不清了，最近不做这个只好等有机会再试了。就是突然想到这个问题了，它的退货温度是不是比普通PCR要高这样可以减少非特异条带？引物加量是不是处于整个基因中间位置的浓度低些？是不是比普通的PCR要多注意些呢