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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 部分蛋白不能进入非变性聚丙烯酰胺胶体内
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cisong

银虫 (小有名气)

[交流] 部分蛋白不能进入非变性聚丙烯酰胺胶体内

做细菌未知功能蛋白的胶内分离纯化，估计此蛋白是细胞膜外面疏松结合蛋白，菌体破碎是用高压破碎仪，压力在12000psi，破碎5次，破碎后添加1%的LDAO增加蛋白溶解度，然后超滤浓缩，再跑胶分离纯化。非变性胶，4%的堆积胶，pH6.8；8%的分离胶，pH8.8。110V，20分钟，然后220V，3h，但是考马斯亮蓝然后发现部分蛋白没有进入非变性聚丙烯酰胺胶体内，在上样槽底部，而这部分蛋白正是自己要的蛋白。特发帖求大侠分析下，采取什么措施能增大蛋白进入胶体的可能性。谢谢！
部分蛋白不能进入非变性聚丙烯酰胺胶体内
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1楼 2013-11-22 10:32:29
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Davidzjy

铁杆木虫 (正式写手)
★
cisong(金币+1): 谢谢参与
弥散的都很厉害啊。。。
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4楼2013-11-22 10:59:30
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同东中郎将

新虫 (小有名气)
★ ★ ★
cisong(金币+1): 谢谢参与
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-22 12:59:44
你的蛋白确实分子量太大？？
样品上样前要离心一下，点样点上清。
要不就是跑一下变性胶对比一下。
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5楼2013-11-22 11:22:05
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
cisong(金币+1): 谢谢参与
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-22 12:59:38
这很正常。非变性胶条件下，有些蛋白形成多亚基大分子复合体，分子量可以高达mega Dalton级别，不能进入stacking胶也很正常。你先确定要分离的蛋白/蛋白复合体的分子量大致是多少，然后再选择合适的分离PAGE体系。
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6楼2013-11-22 11:26:17
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lastpython

木虫 (职业作家)
★
cisong(金币+1): 谢谢参与
Best wishes
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9楼2013-11-22 12:19:14
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cisong

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-11-22 11:26:17
这很正常。非变性胶条件下，有些蛋白形成多亚基大分子复合体，分子量可以高达mega Dalton级别，不能进入stacking胶也很正常。你先确定要分离的蛋白/蛋白复合体的分子量大致是多少，然后再选择合适的分离PAGE体系。

您好，谢谢您的回复。我想问下，如果是因为分子量太大的缘故，是不是可以考虑跑琼脂糖电泳？琼脂糖的孔径是不是会大很多。
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10楼2013-11-22 12:19:37
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b729

金虫 (文坛精英)
★
cisong(金币+1): 谢谢参与
深深祝福
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11楼2013-11-22 12:21:17
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checkin

银虫 (知名作家)
★
cisong(金币+1): 谢谢参与
愿楼主心想事成
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12楼2013-11-22 12:21:25
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muchfan

木虫 (知名作家)
★
cisong(金币+1): 谢谢参与
Best wishes
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13楼2013-11-22 12:21:27
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heibi

金虫 (文坛精英)
★
cisong(金币+1): 谢谢参与
深深祝福
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14楼2013-11-22 12:22:34
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AnnF

版主 (文坛精英)
★
cisong(金币+1): 谢谢参与
楼主很好很强大
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16楼2013-11-22 12:41:51
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fuyuandj86

版主 (著名写手)
★
cisong(金币+1): 谢谢参与
你这是非变性胶的话蛋白都不一定带负电荷吧，如果等电点不对带正电荷的蛋白，当然会跑不动
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18楼2013-11-22 14:02:37
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
10楼: Originally posted by cisong at 2013-11-22 12:19:37
您好，谢谢您的回复。我想问下，如果是因为分子量太大的缘故，是不是可以考虑跑琼脂糖电泳？琼脂糖的孔径是不是会大很多。...

是的，琼脂糖凝胶的孔径要大很多，不过分辨率相对也要差，除非你的分子量非常大。对于聚丙烯酰胺凝胶，你可以考虑改变丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺的比例来增加孔径大小。
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19楼2013-11-22 23:29:23
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丫头7976

铜虫 (正式写手)
★
cisong(金币+1): 谢谢参与
我也遇到过这种情况，你的上样buffer里含有G250吗，或者降低盐浓度试试。在同样的条件下把marker跑一下，看看是样品的问题还是胶的问题，还有，你的胶是买的还是自己灌制的？
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cisong
21楼2014-03-16 20:08:34
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ghqiu09

禁虫 (正式写手)
★
cisong(金币+1): 谢谢参与
本帖内容被屏蔽
22楼2014-03-16 20:19:57
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一品木乃伊

木虫 (初入文坛)
★
cisong(金币+1): 谢谢参与
感觉不是蛋白的问题，是你的核酸没打断。所以造成拖尾严重，整个泳道什么条带都看不出来，还有，你怎么确定孔里的就是你的蛋白。你的蛋白多大？是否会容易聚集？

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23楼2014-03-17 15:26:03
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cisong

银虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
21楼: Originally posted by 丫头7976 at 2014-03-16 20:08:34
我也遇到过这种情况，你的上样buffer里含有G250吗，或者降低盐浓度试试。在同样的条件下把marker跑一下，看看是样品的问题还是胶的问题，还有，你的胶是买的还是自己灌制的？

上样buffer不含G250，盐浓度是50mM的NaCl，很多地方说非变性胶没必要跑marker，所以自己也就没有买。自己罐的胶。还请指点。谢谢！
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24楼2014-03-18 11:54:21
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cisong

银虫 (小有名气)
引用回帖:
22楼: Originally posted by ghqiu09 at 2014-03-16 20:19:57
突然想问，你的marker上哪了？

非变性胶，很多地方说不要marker，所以就没有买了。
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25楼2014-03-18 11:54:58
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cisong

银虫 (小有名气)
引用回帖:
23楼: Originally posted by 一品木乃伊 at 2014-03-17 15:26:03
感觉不是蛋白的问题，是你的核酸没打断。所以造成拖尾严重，整个泳道什么条带都看不出来，还有，你怎么确定孔里的就是你的蛋白。你的蛋白多大？是否会容易聚集？

菌体破碎是用高压破碎，按说核酸会在破碎过程中也被打断。蛋白不会太大，应该是能进入胶体的，因为我的胶浓度很低，都做到4%了，这个浓度理论上可以分离3000KDa的蛋白了。是否凝聚不清楚，因为是未知蛋白，但是以前对样品做过浓度梯度的稀释（2、4、8、16、32、64倍），低浓度的样品也进不去。
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26楼2014-03-18 11:59:55
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樱雪诺风

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
非变性的话，有可能蛋白的电荷是正电，电场力是往负极走的。
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27楼2014-03-25 16:18:03
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简单回复
我要双休日2楼
2013-11-22 10:52   回复  
cisong(金币+1): 谢谢参与
ohcesc3楼
2013-11-22 10:52   回复  
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westlife9117楼
2013-11-22 11:27   回复  
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xiejf8楼
2013-11-22 12:05   回复  
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lefantian12215楼
2013-11-22 12:26   回复  
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黄山松5017楼
2013-11-22 12:48   回复  
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neu23420楼
2013-11-23 15:06   回复  
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