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cisong

银虫 (小有名气)

[交流] 部分蛋白不能进入非变性聚丙烯酰胺胶体内

做细菌未知功能蛋白的胶内分离纯化，估计此蛋白是细胞膜外面疏松结合蛋白，菌体破碎是用高压破碎仪，压力在12000psi，破碎5次，破碎后添加1%的LDAO增加蛋白溶解度，然后超滤浓缩，再跑胶分离纯化。非变性胶，4%的堆积胶，pH6.8；8%的分离胶，pH8.8。110V，20分钟，然后220V，3h，但是考马斯亮蓝然后发现部分蛋白没有进入非变性聚丙烯酰胺胶体内，在上样槽底部，而这部分蛋白正是自己要的蛋白。特发帖求大侠分析下，采取什么措施能增大蛋白进入胶体的可能性。谢谢！
部分蛋白不能进入非变性聚丙烯酰胺胶体内
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1楼 2013-11-22 10:32:29
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cisong

银虫 (小有名气)
引用回帖:
23楼: Originally posted by 一品木乃伊 at 2014-03-17 15:26:03
感觉不是蛋白的问题，是你的核酸没打断。所以造成拖尾严重，整个泳道什么条带都看不出来，还有，你怎么确定孔里的就是你的蛋白。你的蛋白多大？是否会容易聚集？

菌体破碎是用高压破碎，按说核酸会在破碎过程中也被打断。蛋白不会太大，应该是能进入胶体的，因为我的胶浓度很低，都做到4%了，这个浓度理论上可以分离3000KDa的蛋白了。是否凝聚不清楚，因为是未知蛋白，但是以前对样品做过浓度梯度的稀释（2、4、8、16、32、64倍），低浓度的样品也进不去。
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26楼2014-03-18 11:59:55
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Davidzjy

铁杆木虫 (正式写手)
★
cisong(金币+1): 谢谢参与
弥散的都很厉害啊。。。
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4楼2013-11-22 10:59:30
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同东中郎将

新虫 (小有名气)
★ ★ ★
cisong(金币+1): 谢谢参与
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-22 12:59:44
你的蛋白确实分子量太大？？
样品上样前要离心一下，点样点上清。
要不就是跑一下变性胶对比一下。
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5楼2013-11-22 11:22:05
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
cisong(金币+1): 谢谢参与
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-22 12:59:38
这很正常。非变性胶条件下，有些蛋白形成多亚基大分子复合体，分子量可以高达mega Dalton级别，不能进入stacking胶也很正常。你先确定要分离的蛋白/蛋白复合体的分子量大致是多少，然后再选择合适的分离PAGE体系。
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6楼2013-11-22 11:26:17
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