应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 部分蛋白不能进入非变性聚丙烯酰胺胶体内
271/1返回列表
查看: 3578  |  回复: 26
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

cisong

银虫 (小有名气)

[交流] 部分蛋白不能进入非变性聚丙烯酰胺胶体内

做细菌未知功能蛋白的胶内分离纯化，估计此蛋白是细胞膜外面疏松结合蛋白，菌体破碎是用高压破碎仪，压力在12000psi，破碎5次，破碎后添加1%的LDAO增加蛋白溶解度，然后超滤浓缩，再跑胶分离纯化。非变性胶，4%的堆积胶，pH6.8；8%的分离胶，pH8.8。110V，20分钟，然后220V，3h，但是考马斯亮蓝然后发现部分蛋白没有进入非变性聚丙烯酰胺胶体内，在上样槽底部，而这部分蛋白正是自己要的蛋白。特发帖求大侠分析下，采取什么措施能增大蛋白进入胶体的可能性。谢谢！
部分蛋白不能进入非变性聚丙烯酰胺胶体内
DSCN9311_副本.jpg
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2013-11-22 10:32:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Davidzjy

铁杆木虫 (正式写手)
★
cisong(金币+1): 谢谢参与
弥散的都很厉害啊。。。
赞一下 回复此楼
4楼2013-11-22 10:59:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

同东中郎将

新虫 (小有名气)
★ ★ ★
cisong(金币+1): 谢谢参与
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-22 12:59:44
你的蛋白确实分子量太大？？
样品上样前要离心一下，点样点上清。
要不就是跑一下变性胶对比一下。
赞一下 回复此楼
5楼2013-11-22 11:22:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
cisong(金币+1): 谢谢参与
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-22 12:59:38
这很正常。非变性胶条件下，有些蛋白形成多亚基大分子复合体，分子量可以高达mega Dalton级别，不能进入stacking胶也很正常。你先确定要分离的蛋白/蛋白复合体的分子量大致是多少，然后再选择合适的分离PAGE体系。
赞一下 回复此楼
6楼2013-11-22 11:26:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lastpython

木虫 (职业作家)
★
cisong(金币+1): 谢谢参与
Best wishes
回复此楼
9楼2013-11-22 12:19:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cisong

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-11-22 11:26:17
这很正常。非变性胶条件下，有些蛋白形成多亚基大分子复合体，分子量可以高达mega Dalton级别，不能进入stacking胶也很正常。你先确定要分离的蛋白/蛋白复合体的分子量大致是多少，然后再选择合适的分离PAGE体系。

您好，谢谢您的回复。我想问下，如果是因为分子量太大的缘故，是不是可以考虑跑琼脂糖电泳？琼脂糖的孔径是不是会大很多。
赞一下 回复此楼
10楼2013-11-22 12:19:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

b729

金虫 (文坛精英)
★
cisong(金币+1): 谢谢参与
深深祝福
回复此楼
11楼2013-11-22 12:21:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

checkin

银虫 (知名作家)
★
cisong(金币+1): 谢谢参与
愿楼主心想事成
回复此楼
12楼2013-11-22 12:21:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

muchfan

木虫 (知名作家)
★
cisong(金币+1): 谢谢参与
Best wishes
回复此楼
13楼2013-11-22 12:21:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

heibi

金虫 (文坛精英)
★
cisong(金币+1): 谢谢参与
深深祝福
回复此楼
14楼2013-11-22 12:22:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

AnnF

版主 (文坛精英)
★
cisong(金币+1): 谢谢参与
楼主很好很强大
回复此楼
16楼2013-11-22 12:41:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fuyuandj86

版主 (著名写手)
★
cisong(金币+1): 谢谢参与
你这是非变性胶的话蛋白都不一定带负电荷吧，如果等电点不对带正电荷的蛋白，当然会跑不动
赞一下 回复此楼
18楼2013-11-22 14:02:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
10楼: Originally posted by cisong at 2013-11-22 12:19:37
您好，谢谢您的回复。我想问下，如果是因为分子量太大的缘故，是不是可以考虑跑琼脂糖电泳？琼脂糖的孔径是不是会大很多。...

是的，琼脂糖凝胶的孔径要大很多，不过分辨率相对也要差，除非你的分子量非常大。对于聚丙烯酰胺凝胶，你可以考虑改变丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺的比例来增加孔径大小。
赞一下 回复此楼
19楼2013-11-22 23:29:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

丫头7976

铜虫 (正式写手)
★
cisong(金币+1): 谢谢参与
我也遇到过这种情况，你的上样buffer里含有G250吗，或者降低盐浓度试试。在同样的条件下把marker跑一下，看看是样品的问题还是胶的问题，还有，你的胶是买的还是自己灌制的？
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

cisong
21楼2014-03-16 20:08:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ghqiu09

禁虫 (正式写手)
★
cisong(金币+1): 谢谢参与
本帖内容被屏蔽
22楼2014-03-16 20:19:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

一品木乃伊

木虫 (初入文坛)
★
cisong(金币+1): 谢谢参与
感觉不是蛋白的问题，是你的核酸没打断。所以造成拖尾严重，整个泳道什么条带都看不出来，还有，你怎么确定孔里的就是你的蛋白。你的蛋白多大？是否会容易聚集？

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
23楼2014-03-17 15:26:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cisong

银虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
21楼: Originally posted by 丫头7976 at 2014-03-16 20:08:34
我也遇到过这种情况，你的上样buffer里含有G250吗，或者降低盐浓度试试。在同样的条件下把marker跑一下，看看是样品的问题还是胶的问题，还有，你的胶是买的还是自己灌制的？

上样buffer不含G250，盐浓度是50mM的NaCl，很多地方说非变性胶没必要跑marker，所以自己也就没有买。自己罐的胶。还请指点。谢谢！
赞一下 回复此楼
24楼2014-03-18 11:54:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cisong

银虫 (小有名气)
引用回帖:
22楼: Originally posted by ghqiu09 at 2014-03-16 20:19:57
突然想问，你的marker上哪了？

非变性胶，很多地方说不要marker，所以就没有买了。
赞一下 回复此楼
25楼2014-03-18 11:54:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cisong

银虫 (小有名气)
引用回帖:
23楼: Originally posted by 一品木乃伊 at 2014-03-17 15:26:03
感觉不是蛋白的问题，是你的核酸没打断。所以造成拖尾严重，整个泳道什么条带都看不出来，还有，你怎么确定孔里的就是你的蛋白。你的蛋白多大？是否会容易聚集？

菌体破碎是用高压破碎，按说核酸会在破碎过程中也被打断。蛋白不会太大，应该是能进入胶体的，因为我的胶浓度很低，都做到4%了，这个浓度理论上可以分离3000KDa的蛋白了。是否凝聚不清楚，因为是未知蛋白，但是以前对样品做过浓度梯度的稀释（2、4、8、16、32、64倍），低浓度的样品也进不去。
赞一下 回复此楼
26楼2014-03-18 11:59:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

樱雪诺风

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
非变性的话，有可能蛋白的电荷是正电，电场力是往负极走的。
赞一下 回复此楼
27楼2014-03-25 16:18:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
简单回复
我要双休日2楼
2013-11-22 10:52   回复  
cisong(金币+1): 谢谢参与
ohcesc3楼
2013-11-22 10:52   回复  
cisong(金币+1): 谢谢参与
1
westlife9117楼
2013-11-22 11:27   回复  
cisong(金币+1): 谢谢参与
1
xiejf8楼
2013-11-22 12:05   回复  
cisong(金币+1): 谢谢参与
lefantian12215楼
2013-11-22 12:26   回复  
cisong(金币+1): 谢谢参与
黄山松5017楼
2013-11-22 12:48   回复  
cisong(金币+1): 谢谢参与
neu23420楼
2013-11-23 15:06   回复  
cisong(金币+1): 谢谢参与
相关版块跳转 我要订阅楼主 cisong 的主题更新
271/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 2026国自然函评费到账 +17 羊腰板 2026-08-21 18/900 2026-08-24 12:03 by iaeyuan
[基金申请] 建议基金发布提前给出明确的时间点 +12 kulium 2026-08-21 15/750 2026-08-24 12:02 by iaeyuan
[基金申请] 范进中举一文的中心思想 +6 炎黄贵胄 2026-08-22 7/350 2026-08-24 11:58 by 6543yes
[基金申请] 能否退出参与的面上项目解除限项 +11 koalala 2026-08-24 13/650 2026-08-24 10:49 by anjeeshine
[基金申请] 让我中一个面上吧！ +13 大萍1987 2026-08-20 16/800 2026-08-24 10:23 by 太傻了
[基金申请] 科研孤儿太难了 +18 我4大白菜 2026-08-20 19/950 2026-08-24 09:47 by 凯恩广盛催化分�
[基金申请] 明天应该可查了！？ +4 chengyan1220 2026-08-23 4/200 2026-08-24 08:47 by gloomy6159
[基金申请] 什么时候开奖？ +10 CrisMessi 2026-08-18 11/550 2026-08-24 06:50 by 开心的小狮子
[基金申请] 2026年的国家社科基金项目通讯评审的新规则与新动向、新挑战 +4 process2012 2026-08-23 5/250 2026-08-23 19:58 by jurkat.1640
[基金申请] 93BebMhtakh前后11位开头都是大写 +7 且听虎啸 2026-08-17 8/400 2026-08-22 21:55 by 医学老男孩
[基金申请] 只有每年这种时候来逛逛小木虫 +24 yaoyewhu2008 2026-08-20 26/1300 2026-08-22 17:43 by kammury
[基金申请] filecode，4个jtjc了 +13 ziyangfang 2026-08-19 16/800 2026-08-22 17:08 by WH3796
[基金申请] 人气不行了 +8 fansofjerry 2026-08-21 8/400 2026-08-22 16:30 by zyqchem
[基金申请] 时间戳今天，20号变了 +5 archvillain 2026-08-20 5/250 2026-08-22 06:12 by hui_daxiao
[基金申请] 今日不放榜？网传国自然预计 8 月 27 日可查结果 +16 医学老男孩 2026-08-20 20/1000 2026-08-21 21:13 by Ldrop2023
[基金申请] 时间戳又变了 +13 wuchongjun 2026-08-20 19/950 2026-08-21 17:21 by 紫杉醇
[基金申请] 我面上完蛋了 +7 且听虎啸 2026-08-20 8/400 2026-08-21 12:31 by 酷酷墨镜
[基金申请] 应该是下周三26日公布了吧？ +4 哈哈蛤？ 2026-08-21 4/200 2026-08-21 10:58 by Vivilian
[基金申请] 明天放榜？ +5 Shxjjxjkx 2026-08-18 5/250 2026-08-18 18:14 by -大大大大大-
[基金申请] 今天维护系统维护 祝所有人 高中 +8 gjjjzhong 2026-08-18 9/450 2026-08-18 13:01 by 家与远方
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭