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cisong

银虫 (小有名气)

[交流] 部分蛋白不能进入非变性聚丙烯酰胺胶体内

做细菌未知功能蛋白的胶内分离纯化，估计此蛋白是细胞膜外面疏松结合蛋白，菌体破碎是用高压破碎仪，压力在12000psi，破碎5次，破碎后添加1%的LDAO增加蛋白溶解度，然后超滤浓缩，再跑胶分离纯化。非变性胶，4%的堆积胶，pH6.8；8%的分离胶，pH8.8。110V，20分钟，然后220V，3h，但是考马斯亮蓝然后发现部分蛋白没有进入非变性聚丙烯酰胺胶体内，在上样槽底部，而这部分蛋白正是自己要的蛋白。特发帖求大侠分析下，采取什么措施能增大蛋白进入胶体的可能性。谢谢！
部分蛋白不能进入非变性聚丙烯酰胺胶体内
DSCN9311_副本.jpg
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1楼 2013-11-22 10:32:29
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cisong

银虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
21楼: Originally posted by 丫头7976 at 2014-03-16 20:08:34
我也遇到过这种情况，你的上样buffer里含有G250吗，或者降低盐浓度试试。在同样的条件下把marker跑一下，看看是样品的问题还是胶的问题，还有，你的胶是买的还是自己灌制的？

上样buffer不含G250，盐浓度是50mM的NaCl，很多地方说非变性胶没必要跑marker，所以自己也就没有买。自己罐的胶。还请指点。谢谢！
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24楼2014-03-18 11:54:21
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Davidzjy

铁杆木虫 (正式写手)
★
cisong(金币+1): 谢谢参与
弥散的都很厉害啊。。。
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4楼2013-11-22 10:59:30
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同东中郎将

新虫 (小有名气)
★ ★ ★
cisong(金币+1): 谢谢参与
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-22 12:59:44
你的蛋白确实分子量太大？？
样品上样前要离心一下，点样点上清。
要不就是跑一下变性胶对比一下。
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5楼2013-11-22 11:22:05
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
cisong(金币+1): 谢谢参与
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-22 12:59:38
这很正常。非变性胶条件下，有些蛋白形成多亚基大分子复合体，分子量可以高达mega Dalton级别，不能进入stacking胶也很正常。你先确定要分离的蛋白/蛋白复合体的分子量大致是多少，然后再选择合适的分离PAGE体系。
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6楼2013-11-22 11:26:17
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