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cisong

银虫 (小有名气)

[交流] 部分蛋白不能进入非变性聚丙烯酰胺胶体内

做细菌未知功能蛋白的胶内分离纯化，估计此蛋白是细胞膜外面疏松结合蛋白，菌体破碎是用高压破碎仪，压力在12000psi，破碎5次，破碎后添加1%的LDAO增加蛋白溶解度，然后超滤浓缩，再跑胶分离纯化。非变性胶，4%的堆积胶，pH6.8；8%的分离胶，pH8.8。110V，20分钟，然后220V，3h，但是考马斯亮蓝然后发现部分蛋白没有进入非变性聚丙烯酰胺胶体内，在上样槽底部，而这部分蛋白正是自己要的蛋白。特发帖求大侠分析下，采取什么措施能增大蛋白进入胶体的可能性。谢谢！
部分蛋白不能进入非变性聚丙烯酰胺胶体内
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1楼 2013-11-22 10:32:29
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
10楼: Originally posted by cisong at 2013-11-22 12:19:37
您好，谢谢您的回复。我想问下，如果是因为分子量太大的缘故，是不是可以考虑跑琼脂糖电泳？琼脂糖的孔径是不是会大很多。...

是的，琼脂糖凝胶的孔径要大很多，不过分辨率相对也要差，除非你的分子量非常大。对于聚丙烯酰胺凝胶，你可以考虑改变丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺的比例来增加孔径大小。
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19楼2013-11-22 23:29:23
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Davidzjy

铁杆木虫 (正式写手)
★
cisong(金币+1): 谢谢参与
弥散的都很厉害啊。。。
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4楼2013-11-22 10:59:30
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同东中郎将

新虫 (小有名气)
★ ★ ★
cisong(金币+1): 谢谢参与
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-22 12:59:44
你的蛋白确实分子量太大？？
样品上样前要离心一下，点样点上清。
要不就是跑一下变性胶对比一下。
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5楼2013-11-22 11:22:05
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
cisong(金币+1): 谢谢参与
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-22 12:59:38
这很正常。非变性胶条件下，有些蛋白形成多亚基大分子复合体，分子量可以高达mega Dalton级别，不能进入stacking胶也很正常。你先确定要分离的蛋白/蛋白复合体的分子量大致是多少，然后再选择合适的分离PAGE体系。
赞一下 回复此楼
6楼2013-11-22 11:26:17
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