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huangyan0517

金虫 (小有名气)

[求助] SDS-PAGE出问题了，高手指教

溶液都是新配的，15%分离胶，5%浓缩胶，2倍loading buffer我自己配的。下图里，前两个用到是我用自己的buffer做的marker，就是检验一下buffer好不好，只有两种蛋白溶菌酶和BSA，后面是买的marker。在后是我的样品，现在问题是，我的loading buffer好像不怎么样，同时蛋白跑的距离太短，以前同样条件基本上跑到底了，现在才在中间。问题出在哪？
SDS-PAGE出问题了，高手指教
20131114002.jpg
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时间在哪里，成就就在哪里
1楼 2013-11-14 10:39:24
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huangyan0517

金虫 (小有名气)
电压为80V，30min，120V，50min。高不高？
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时间在哪里，成就就在哪里
2楼2013-11-14 10:57:44
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-14 23:24:24
胶不是很清晰，检查配胶缓冲液的pH，电泳缓冲液是不是对。如果蛋白的迁移率差很多，可能是丙烯酰胺母液中的丙烯酰胺：甲叉丙烯酰胺的比例不对。如果怀疑是loading buffer的问题，重新配置一下看看。
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3楼2013-11-14 13:31:23
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
2楼: Originally posted by huangyan0517 at 2013-11-14 10:57:44
电压为80V，30min，120V，50min。高不高？

小胶一般就这么跑的。你的电泳过程中电流是多少？
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4楼2013-11-14 13:32:15
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huangyan0517

金虫 (小有名气)
80v，19ma，1.5w；120v，17ma，2.1w。pH没问题，丙烯酰胺就是29:1，这个我确定没问题。电泳盒里的缓冲液是旧的，板之间的是新的，应该没问题，电泳缓冲液pH重要吗，要8.3吗？按分子克隆书上配的5倍的，没调过pH。现在看，胶本身没问题，预染marker跑的还行，虽然最上面和最先面的条带不清楚（应该有6条，现在能看清的只有4条）。问题可能还是自己配的loading buffer的问题，loading buffer 我就是用配胶的pH6.8 1M tris缓冲液配的。
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时间在哪里，成就就在哪里
5楼2013-11-14 13:47:38
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huangyan0517

金虫 (小有名气)
6.8和8.8的tris缓冲液要求有多严格，比如pH6.8，实际6.7或6.9影响大吗？
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时间在哪里，成就就在哪里
6楼2013-11-14 13:59:37
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doglet

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-14 23:24:32
15%的SDS-PAGE有点浓，的确容易出现这种情况，但是不应该出现MARKER缺带的情况，看看你的marker是多大分子量的，能不能用15%的胶，其次你的PAGE胶配的不够好，从新配的好，电泳液我一般可以用3-4次，电流我用50mA，电压有时到100-200V，胶都有点烫了也没有关系，pH只要差的不多就行，我们使用pH试纸测的，用5.5-9.0的试纸
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7楼2013-11-14 20:59:03
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jennifermatt

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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试剂还是重新配吧。要不然找原因很麻烦的。
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求是
8楼2013-11-15 11:00:30
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爵士小孩

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我觉得应该先看看你的marker分子量大小，再来确定分离胶的浓度
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我就是我！
9楼2013-11-15 15:48:37
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huangyan0517

金虫 (小有名气)
试剂全部重配，问题解决，不知道当初哪个配错了
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时间在哪里，成就就在哪里
10楼2013-11-17 18:34:47
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