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huangyan0517

金虫 (小有名气)

[求助] SDS-PAGE出问题了,高手指教

溶液都是新配的,15%分离胶,5%浓缩胶,2倍loading buffer我自己配的。下图里,前两个用到是我用自己的buffer做的marker,就是检验一下buffer好不好,只有两种蛋白溶菌酶和BSA,后面是买的marker。在后是我的样品,现在问题是,我的loading buffer好像不怎么样,同时蛋白跑的距离太短,以前同样条件基本上跑到底了,现在才在中间。问题出在哪?
SDS-PAGE出问题了,高手指教
20131114002.jpg
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huangyan0517

金虫 (小有名气)

电压为80V,30min,120V,50min。高不高?
时间在哪里,成就就在哪里
2楼2013-11-14 10:57:44
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-11-14 23:24:24
胶不是很清晰,检查配胶缓冲液的pH,电泳缓冲液是不是对。如果蛋白的迁移率差很多,可能是丙烯酰胺母液中的丙烯酰胺:甲叉丙烯酰胺的比例不对。如果怀疑是loading buffer的问题,重新配置一下看看。
3楼2013-11-14 13:31:23
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
2楼: Originally posted by huangyan0517 at 2013-11-14 10:57:44
电压为80V,30min,120V,50min。高不高?

小胶一般就这么跑的。你的电泳过程中电流是多少?
4楼2013-11-14 13:32:15
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huangyan0517

金虫 (小有名气)

80v,19ma,1.5w;120v,17ma,2.1w。pH没问题,丙烯酰胺就是29:1,这个我确定没问题。电泳盒里的缓冲液是旧的,板之间的是新的,应该没问题,电泳缓冲液pH重要吗,要8.3吗?按分子克隆书上配的5倍的,没调过pH。现在看,胶本身没问题,预染marker跑的还行,虽然最上面和最先面的条带不清楚(应该有6条,现在能看清的只有4条)。问题可能还是自己配的loading buffer的问题,loading buffer 我就是用配胶的pH6.8 1M tris缓冲液配的。
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5楼2013-11-14 13:47:38
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huangyan0517

金虫 (小有名气)

6.8和8.8的tris缓冲液要求有多严格,比如pH6.8,实际6.7或6.9影响大吗?
时间在哪里,成就就在哪里
6楼2013-11-14 13:59:37
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doglet

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-11-14 23:24:32
15%的SDS-PAGE有点浓,的确容易出现这种情况,但是不应该出现MARKER缺带的情况,看看你的marker是多大分子量的,能不能用15%的胶,其次你的PAGE胶配的不够好,从新配的好,电泳液我一般可以用3-4次,电流我用50mA,电压有时到100-200V,胶都有点烫了也没有关系,pH只要差的不多就行,我们使用pH试纸测的,用5.5-9.0的试纸
7楼2013-11-14 20:59:03
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jennifermatt

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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试剂还是重新配吧。要不然找原因很麻烦的。
求是
8楼2013-11-15 11:00:30
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爵士小孩

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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我觉得应该先看看你的marker分子量大小,再来确定分离胶的浓度
我就是我!
9楼2013-11-15 15:48:37
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huangyan0517

金虫 (小有名气)

试剂全部重配,问题解决,不知道当初哪个配错了
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10楼2013-11-17 18:34:47
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