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麦堂straw银虫 (小有名气)
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[求助]
酵母表达的蛋白条带十分弥散，还请高手指教
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用酵母表达一个蛋白酶，跑SDS-PAGE分析发现目的条带十分弥散，而且和按照氨基酸序列算出来的45kDa的分子量大小相差很大，该蛋白酶为胞外表达，表达出来的蛋白酶具有酶活性。 纠结 ①为什么根据SDS-PAGE迁移率算的蛋白大小（60kDa左右）和根据氨基酸序列算的蛋白大小（45kDa左右）相差这么大（一般发生糖基化也就增加几千道尔顿而已） ②为什么条带会这么的弥散？ 还望高手不吝赐教，谢谢！ 以下为我跑的SDS-PAGE图  10.31sdspage.jpg [ Last edited by 麦堂straw on 2012-11-16 at 11:20 ] |
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【答案】应助回帖
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我也做酵母（毕赤），交流一下。 1. 分子量方面，我觉得问题不大，SDS-PAGE上的行为有时与理论值有很大出入，这个与蛋白的组成、成分等相关， 一般我是通过表达阴性对照来初步判断，特别是像这种分泌表达的，应该更好分辨些，若需进一步测定，应该是 WB、elisa、活性检测了。 2. 电泳前样品可有处理过，表达产物可能还有一些色素什么的，可有除去？我觉得可能是这些影响了。 |
2楼2012-11-16 15:39:36
麦堂straw
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感谢回复~ 1.阴性对照我有做过就是没有任何条带的，因为酵母里表达的这个蛋白酶基因是从曲霉中克隆出来的，我同时做过曲霉天然的蛋白酶表达，条带更加复杂，以至于我都不知道到底哪条带才是目的条带。想请教一下，对于这种情况，跑明胶PAGE能否检测该活性或者更方便些，因为这也是别人建议，WB以前从没做过，貌似挺麻烦的说~~ 2.确实如你所说，我的蛋白样品是直接用酵母表达上清进行硫酸铵沉淀浓缩再透析后收集得到，蛋白样品偏黄，和一般大肠表达收集的蛋白不太一样，不知道是不是这个原因，如果是的话，请教该如何进行蛋白的脱色呢？ 由于刚做这方面实验，各种经验不足各种小白，还望兄台多多指教，拜托拜托~ |
3楼2012-11-17 13:30:23
linxt2005
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