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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请高手帮忙分析一下这个PCR产物凝胶电泳图
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thornbird

铜虫 (小有名气)

博士

[求助] 请高手帮忙分析一下这个PCR产物凝胶电泳图

试剂        体积（ 25ul）
ddH2O                 15.6ul
10 x buffer          2.5ul
10×dNTP（2 mM）2.5ul
上游Primer（50 μM) 1ul
下游Primer（50 μM) 1ul
模板（650 ng/mL gDNA) 2ul
Mg（25 mM MgSO4）0.6ul
高保真Taq 酶（2.5U）0.8ul

采用BIO-RADT100 PCR仪。第1-2孔为刚提的小麦gDNA,第3孔为DL2000 Marker.第4-14孔是以cDNA为模板（是两个月前反转录的，现在浓度为38 ng/μL，260/280约为1.3),第15-25孔为刚提的gDNA为模板。
4-14孔的模板cDNA原以为浓度还能维持在500 μg/ml 左右，所以用前没测，为什么在-20 ℃下降解如此迅速？
15-17点样的产物是46.1、47.5、48.5 ℃梯度PCR的结果（生工报告单上Tm值分别为49.07和50.47），预计条带为1500-2000 bp,结果好像有250 bp左右的产物？
18-25点样的产物是另一对引物在37.0 -48.5 ℃共8个温带梯度下的结果（Tm值分别为43.86和52.94），预计条带为1500-2000 bp，结果16-19及22有250 bp左右的产物？

实验目的是克隆一个基因的coding sequence,直接涉及含起始密码子和终止子的引物二级结构值偏大。所以按拼接预测的3‘，5’端设计了较短的引物。一对引物长度分别为13、18，GC含量分别为61.54%和38.89%，另一对长度分别为14、16,GC含量分别为64.29%和31.25%。

现在准备重提mRNA,转录cDNA用于扩增。请虫友提提建议！不甚感激！
请高手帮忙分析一下这个PCR产物凝胶电泳图
IMG_20131103_194520.jpg
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博士万岁
1楼 2013-11-03 22:47:19
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machao8405

木虫 (正式写手)
个人觉得是引物特异性不好

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2013-11-03 23:03:14
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zhang宇微

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 鼓励发帖积极交流。 2013-11-04 08:32:25
thornbird: 金币+1, ★有帮助 2013-11-04 11:42:53
Tap酶也有高保真的吗？fast Pfu酶是高保真的聚合酶

[ 发自小木虫客户端 ]
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3楼2013-11-03 23:08:14
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
thornbird(myprayer代发): 金币+3, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-11-04 08:32:37
引物使用量太大。一般根据不同酶有调整，种浓度在100nM-1mM。你采用的终浓度是2mM each。这么高浓度的引物，形成引物二聚体也不奇怪了。你确定gDNA的浓度没有错吗？如果真的是你测的浓度，是很稀的样品了。我也就不建议你跑胶查看，可以增加gDNA模板用量。如果你的gDNA溶在水里，可以用10μl模板来P。
不知道你的cDNA样品浓度是真么检测的。如果是反转录形成cDNA第一条链，你是否消化了样品中的RNA模板并纯化去除dNTP？未经纯化的cDNA样品干扰太多，无法直接用微量核酸仪检测。从你跑的胶上看，拖尾严重，感觉样品很脏。感觉cDNA的用量不正确。

我认为你应该先检测引物是否工作，用gDNA模板跑PCR优化条件后再考虑做cDNA的样品。
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thornbird
4楼2013-11-04 01:21:30
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thornbird

铜虫 (小有名气)

博士
引用回帖:
3楼: Originally posted by zhang宇微 at 2013-11-03 23:08:14
Tap酶也有高保真的吗？fast Pfu酶是高保真的聚合酶

用的是KOD-Plus-
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博士万岁
5楼2013-11-04 11:42:38
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thornbird

铜虫 (小有名气)

博士
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-11-04 01:21:30
引物使用量太大。一般根据不同酶有调整，种浓度在100nM-1mM。你采用的终浓度是2mM each。这么高浓度的引物，形成引物二聚体也不奇怪了。你确定gDNA的浓度没有错吗？如果真的是你测的浓度，是很稀的样品了。我也就不 ...

现在准备重新设计引物，想设计一对含上游含ATG和下游含ATC的分别19和22的引物再试试，发现上游有5’端二聚体-13.1kal/mol,GC%为63%；下游3‘端有从第一个碱基开始三连环（Tm=56)，退火温度为70℃。有没有必要尝试？
请教cicelyzh及广大虫友，扩CDS有没有绝招，比如：http://ask.bbioo.com/ask/show-2853.html
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博士万岁
6楼2013-11-05 22:41:41
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