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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 凝胶层析蛋白洗不下来
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任天青

金虫 (小有名气)

[求助] 凝胶层析蛋白洗不下来

各位大神：

我而今算是遇到了最诡异的事了。我用的是Sephadex G-75，手工分多次装柱（没有装柱器），肉眼看来柱子装的比较均匀。之前用蓝色葡聚糖跑了一下，能跑出来。但不论是我的蛋白样品或者是BSA溶液，核酸蛋白检测仪均检测不到蛋白质存在。

详细情况是这样的：
1）第一次装柱，蓝色葡聚糖ok，将我的蛋白液【注】与蓝色葡聚糖混合后再次上样，结果在几乎和蓝色葡聚糖出来的同时，检测仪发现有大量蛋白正在洗出来了。但一个蛋白峰过后，再也没有检测到有任何蛋白洗出。
2）用缓冲液冲洗柱床过夜，次日，加入~1%床体积的BSA溶液，发现一个蛋白吸收峰都没有了。
【注】：溶解目的蛋白液的缓冲液是柱缓冲液的5×形式，上样前已经10000g离心去除了上样中的沉淀。柱是25× Φ2.5cm的，流速约1ml/min(恒压)。

这个会的人应该是很简单的，但小弟这边还是自己摸索，希望大家给予点指导。不胜感激
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实验虐我千百遍，我待实验如初恋...
1楼 2013-10-30 23:01:34
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
137167741: 金币+1, 鼓励交流~~ 2013-11-01 19:22:00
任天青(wizardfan代发): 金币+5, 谢谢参与 2013-11-02 10:24:19
任天青: 金币+4, ★有帮助 2013-11-05 10:24:55
如果你的蛋白质样品不是纯品，那么第一次只有一个峰出来，就表示该柱的分离效果为零。第二次没有吸收峰，有可能是因为蛋白质太少达不到检测下限。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
2楼2013-10-31 19:27:10
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普通回帖

同东中郎将

新虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-11-01 19:22:11
任天青(wizardfan代发): 金币+3, 谢谢参与 2013-11-02 10:24:33
支持2楼
柱是25× Φ2.5cm的？？
也有可能是你的柱子不合适。换个60× Φ1.6cm的柱子试试看。
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曾子曰：“士不可以不弘毅，任重而道远。仁以为己任，不亦重乎？死而后已，不亦远乎？”
3楼2013-10-31 19:38:02
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任天青

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2013-10-31 19:27:10
如果你的蛋白质样品不是纯品，那么第一次只有一个峰出来，就表示该柱的分离效果为零。第二次没有吸收峰，有可能是因为蛋白质太少达不到检测下限。

谢谢冼亮淀粉酶君的解答。我第二次加入的是约1.3ml 1000ug/ml的BSA，样品浓度应该算高了吧。此外，我柱子的规格说错了，是40× Φ2.5cm的，在此表示抱歉。如果说该柱的分离效果为零，那么问题出在什么上面呢？凝胶颗粒还是柱子亦或是糟糕的操作也有可能使这种情况出现？
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实验虐我千百遍，我待实验如初恋...
4楼2013-11-01 09:25:19
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任天青

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 同东中郎将 at 2013-10-31 19:38:02
支持2楼
柱是25× Φ2.5cm的？？
也有可能是你的柱子不合适。换个60× Φ1.6cm的柱子试试看。

谢谢同东中郎将君，我柱子的规格说错了，是40× Φ2.5cm的，在此表示抱歉。此外，Sephadex G-75的说明书上要求柱高最好控制住40-50cm一下，过高的凝胶层会引起较大的反压，应尽量避免、、、
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实验虐我千百遍，我待实验如初恋...
5楼2013-11-01 09:34:03
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
引用回帖:
4楼: Originally posted by 任天青 at 2013-11-01 09:25:19
谢谢冼亮淀粉酶君的解答。我第二次加入的是约1.3ml 1000ug/ml的BSA，样品浓度应该算高了吧。此外，我柱子的规格说错了，是40× Φ2.5cm的，在此表示抱歉。如果说该柱的分离效果为零，那么问题出在什么上面呢？凝胶 ...

会不会是因为自己装的所以柱效差？而且上样量是体积的1%，会不会偏大？
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6楼2013-11-01 17:06:56
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同东中郎将

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 任天青 at 2013-11-01 09:34:03
谢谢同东中郎将君，我柱子的规格说错了，是40× Φ2.5cm的，在此表示抱歉。此外，Sephadex G-75的说明书上要求柱高最好控制住40-50cm一下，过高的凝胶层会引起较大的反压，应尽量避免、、、...

过高的凝胶层会引起较大的反压，应尽量避免??????
这个还真新鲜啊 。
不过还是建议你换个内径小一点柱子试一下。
装柱尽量一次装，不然柱效不给力啊。
没柱效的柱子是赔了夫人又折兵。
还是保证柱效先吧
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7楼2013-11-01 21:52:56
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任天青

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2013-11-01 17:06:56
会不会是因为自己装的所以柱效差？而且上样量是体积的1%，会不会偏大？...

我参考的是来自上海西宝生物的说明书（http://www.docin.com/p-25091200.html）。其他有提到“凝胶过滤的上样量一般为5％的床体积，我们建议初次上样量控制在1－2％的床体积”。
此外，在发完此贴后，我用两根相同的柱子连接在一起做成一个简易的装柱器，一次性完成装柱。用1ml的BSA测试，得到与帖子中提到的第一次的结论相同，即蛋白和蓝色葡聚糖同时被洗出来。
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8楼2013-11-02 00:14:51
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任天青

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 同东中郎将 at 2013-11-01 21:52:56
过高的凝胶层会引起较大的反压，应尽量避免??????
这个还真新鲜啊 。
不过还是建议你换个内径小一点柱子试一下。
装柱尽量一次装，不然柱效不给力啊。
没柱效的柱子是赔了夫人又折兵。
还是保证柱效先吧...

谢谢你的建议，我正在联系换根小柱试试。不过当时考虑大柱，是考虑到自己的样品量充足，可以收获较多的纯化产物
在发完此贴后，我用两根相同的柱子连接在一起做成一个简易的装柱器，一次性完成装柱。用1ml的BSA测试，得到与帖子中提到的第一次的结论相同，即蛋白和蓝色葡聚糖同时被洗出来。
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9楼2013-11-02 00:17:44
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
GE的说明书建议样品体积少于柱床体积的1%
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10楼2013-11-02 16:45:27
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