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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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xinyaolu

木虫 (小有名气)

[求助] 疏水柱为何挂不上蛋白,求解!

本人在做蛋白纯化,使用了GE的pheny(high sub )预装柱。蛋白用40%硫酸铵沉淀后,分别用含有0.5M,1M,1.5M 硫酸铵或者2M Nacl 的50mM pH7.0的磷酸钠缓冲液复溶,膜过滤后均有检测到酶活。
当用高盐溶液平衡柱子后,发现没有任何蛋白挂上柱,随后的洗脱过程中一点蛋白峰都没有,连咋蛋白都没有。
透过液中有检测到酶活。
我的蛋白在40%硫酸铵中基本都沉淀下来。
让我纠结的是为何一点蛋白都没挂上,连杂蛋白都没有
向各位求解!
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jessica2010

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

试试将柱子平衡到酸性再上样
2楼2011-06-08 08:57:06
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xinyaolu

木虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by jessica2010 at 2011-06-08 08:57:06:
试试将柱子平衡到酸性再上样

似乎pH对疏水层析没多少影响吧
3楼2011-06-08 12:54:58
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

等下做层析,晚上再回帖
流星来时我许了个愿,愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具,久不看论坛一来就提问者,宁弃EPI和VIP也不回帖。
4楼2011-06-08 15:11:37
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

上样之后用来平衡的高盐溶液是什么样的溶液,浓度和pH值
流星来时我许了个愿,愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具,久不看论坛一来就提问者,宁弃EPI和VIP也不回帖。
5楼2011-06-08 23:00:41
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月月大可

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
xinyaolu(金币+2): 2011-06-09 22:49:28
lstt09nk(金币+5): 感谢交流 2011-06-12 19:11:57
我的概念中不是所有蛋白都适合使用疏水层析!

如果你尝试的过程中表现的非常不错,恭喜你,疏水层析后一般都会获得纯度非常高的蛋白。如果挂不上柱,表明不适合,更换其他柱子。

我做的几个蛋白除了钙调素能够使用PHE获得极佳的效果外,其他的几个蛋白都不能挂在疏水柱上!
6楼2011-06-09 08:36:12
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xinyaolu

木虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-06-08 23:00:41:
上样之后用来平衡的高盐溶液是什么样的溶液,浓度和pH值

顶楼应该已经说的很清楚了。。。
7楼2011-06-09 22:50:09
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xinyaolu

木虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 月月大可 at 2011-06-09 08:36:12:
我的概念中不是所有蛋白都适合使用疏水层析!

如果你尝试的过程中表现的非常不错,恭喜你,疏水层析后一般都会获得纯度非常高的蛋白。如果挂不上柱,表明不适合,更换其他柱子。

我做的几个蛋白除了钙调素能 ...

主要纠结在一点蛋白都没挂上,连咋的都没
8楼2011-06-09 22:51:07
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tianliudut

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
xinyaolu(金币+2): 2011-06-12 17:42:19
lstt09nk(金币+3): 感谢参与,欢迎再来 2011-06-12 19:12:15
请问你用的柱子体积是多大的?你的样品的体积和浓度?我觉得最有可能是样品被稀释过多倍数造成的。建议换小体积的柱子或增大样品量。另外苯基是最容易结合的了,如果不能结合,需进一步增大硫酸铵浓度,但是这样会增加洗脱难度。
9楼2011-06-12 09:31:38
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mssj300130

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
其实pH对疏水柱还是有一定影响的,只是大部分情况下我们倾向于在中性环境下去挂柱,如果你的pH低于5的话,疏水性是会变强的,另外可以尝试一个硫酸钠,一般来讲硫酸纳,1M左右吧,再高可能溶解不到了,还有就是你在上柱前尝试过加一步硫胺沉淀吗,例如说25%左右的
10楼2012-04-10 15:19:46
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