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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 凝胶层析蛋白洗不下来
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任天青

金虫 (小有名气)

[求助] 凝胶层析蛋白洗不下来

各位大神：

我而今算是遇到了最诡异的事了。我用的是Sephadex G-75，手工分多次装柱（没有装柱器），肉眼看来柱子装的比较均匀。之前用蓝色葡聚糖跑了一下，能跑出来。但不论是我的蛋白样品或者是BSA溶液，核酸蛋白检测仪均检测不到蛋白质存在。

详细情况是这样的：
1）第一次装柱，蓝色葡聚糖ok，将我的蛋白液【注】与蓝色葡聚糖混合后再次上样，结果在几乎和蓝色葡聚糖出来的同时，检测仪发现有大量蛋白正在洗出来了。但一个蛋白峰过后，再也没有检测到有任何蛋白洗出。
2）用缓冲液冲洗柱床过夜，次日，加入~1%床体积的BSA溶液，发现一个蛋白吸收峰都没有了。
【注】：溶解目的蛋白液的缓冲液是柱缓冲液的5×形式，上样前已经10000g离心去除了上样中的沉淀。柱是25× Φ2.5cm的，流速约1ml/min(恒压)。

这个会的人应该是很简单的，但小弟这边还是自己摸索，希望大家给予点指导。不胜感激
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实验虐我千百遍，我待实验如初恋...
1楼 2013-10-30 23:01:34
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
137167741: 金币+1, 鼓励交流~~ 2013-11-01 19:22:00
任天青(wizardfan代发): 金币+5, 谢谢参与 2013-11-02 10:24:19
任天青: 金币+4, ★有帮助 2013-11-05 10:24:55
如果你的蛋白质样品不是纯品，那么第一次只有一个峰出来，就表示该柱的分离效果为零。第二次没有吸收峰，有可能是因为蛋白质太少达不到检测下限。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
2楼2013-10-31 19:27:10
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
引用回帖:
4楼: Originally posted by 任天青 at 2013-11-01 09:25:19
谢谢冼亮淀粉酶君的解答。我第二次加入的是约1.3ml 1000ug/ml的BSA，样品浓度应该算高了吧。此外，我柱子的规格说错了，是40× Φ2.5cm的，在此表示抱歉。如果说该柱的分离效果为零，那么问题出在什么上面呢？凝胶 ...

会不会是因为自己装的所以柱效差？而且上样量是体积的1%，会不会偏大？
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6楼2013-11-01 17:06:56
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
GE的说明书建议样品体积少于柱床体积的1%
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10楼2013-11-02 16:45:27
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
引用回帖:
11楼: Originally posted by 任天青 at 2013-11-02 20:43:46
看到冼亮淀粉酶君在小木虫里的关于凝胶层析的回复，膜拜中(http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=3059537)。话说1ml样品对于我的柱子来说是差不多1%了。因为我的空柱体积约为196ml，我泡凝胶的时候，准备的胶体 ...

其实我做凝胶过滤的时候，无论是用自己装的还是GE的，都失败了，原因未知。所以我也只能谈点理论的东西。
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12楼2013-11-02 20:53:12
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