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金虫 (正式写手)

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[交流] 凝胶层析和装柱以及柱效问题已有9人参与

我在GE的sephacry s-100填料150ml，装在华美的1.6×70dcm的柱子中，做crude extract的分离，第一次装柱，没有用装柱器，用烧杯慢慢灌入，自然沉降。第一次跑得到很好地4个蛋白峰。入图1.1
以后重新装了好几次柱，都跑不出这样的效果，只有一个蛋白峰，后面的峰分不开。安装说明书上2步装柱法装的柱，今天用丙酮安装说明书上的方法测了一下柱效，跑出如下图1.2，这样的图，不知道是什么原因，柱效也没有计算，因为说明书上的测柱效的图，峰是对称的。因为没有装柱器，所以都是没有用，凝胶没有抽气，因为说明书没有要求抽气。凝胶是用dd H2O溶。
   不知道是什么原因，我想可能是过了多次后，柱子强结合的蛋白把微孔堵了，我安装说明用0.5M NaoH 和30%异丙醇洗过，在测住校的。
   安装时的流速都是安装要求，没有超过2ml/min。跑的流速是0.5-0.7ml/min。
   请大家提出宝贵的意见和指点。谢谢大家。

图1.1

图1.2

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1楼2012-03-27 20:40:02

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小新3858

木虫 (正式写手)

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我之前装也出现过你这种情况，就是测柱效的图跟你这差不多，然后又重新装了一次就好了
说明书上提到说如果柱效出现这种峰型那就减小装柱时的流速，我推测原因可能是流速快导致柱子里的介质压得不均匀（上面实下面松），还有一点就是最好用装柱器，装之前介质一定要搅匀了，用玻璃棒慢慢搅，不能有块儿状的，然后往柱子里倒的时候也一定要慢，用玻璃棒引流倒入