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amq7392铁杆木虫 (著名写手)
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请教一下做疏水层析遇到的问题
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我用Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (high sub)纯化一个酶， 上样和平衡缓冲液为50 mM磷酸盐，pH7.0，1 M硫酸铵， 上样后依次用0.8、0.6、0.4、0.2、0 M硫酸铵、蒸馏水阶段式洗脱， 结果每个阶段都出一个峰，每个峰大小差不多，而且每个峰都有酶活，酶活也差不多（不含硫酸铵的buffer、蒸馏水洗脱峰稍大且尖锐，酶活稍高）。 似乎从0.8 M硫酸铵开始就有目标酶洗脱下来，但是又不能完全洗脱，直到用蒸馏水洗，目标酶才全部洗脱下来，而在此过程中目标酶和杂蛋白根本就没分开呀，仅仅在流穿峰当中去掉了一部分不结合的杂质。 问题总结：如果说蛋白和柱子结合的紧，为何在0.8M硫酸铵就有目标蛋白洗脱下来？如果说结合的松，为何0 M硫酸铵仍不能完全洗脱，要用蒸馏水才能完全洗脱？ 为什么在0.8——0M硫酸铵阶段洗脱过程中，每一步都有目标蛋白洗脱下来，而且在每个峰中酶活分布这么均匀？ |
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