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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 有关疏水层析的问题
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zhangyehong

新虫 (初入文坛)

[求助] 有关疏水层析的问题

求助，我近期从发酵液中分离脂肪酶，过完离子柱后，过疏水层析，用的是ＧＥ　ａｋｔａ系统，疏水预装柱，洗脱液用的是１０％的硫酸铵和磷酸缓冲液，但是上样后，硫酸铵洗出了一个大峰，但是后来用缓冲液洗不下来目的蛋白，因为我的样品有颜色，所以从柱子上看到样品还挂在柱子上，不知道什么原因，想求助一高手，实在没辙了，希望和纯化蛋白的高手交流交流。

[ Last edited by wizardfan on 2012-10-25 at 07:36 ]
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1楼 2012-10-22 15:11:30
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ynkuaile

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你蛋白有辅酶或辅基吗？蛋白的颜色是辅酶或辅基的颜色吗？如果没有辅酶，那么换低盐溶液梯度洗脱，或换个低浓度的盐上样，或换个弱一点的疏水柱；如果有辅酶或辅基，那就是辅酶与蛋白分离了。实验顺利。
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zhangyehong
2楼2012-10-22 17:03:39
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
用水洗用水洗用水洗用水洗
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
3楼2012-10-22 18:17:29
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yongbo_liang

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
看天: 金币+3, 鼓励回答 2012-10-30 16:09:22
如果没洗脱下来，就说明你的蛋白的极性很弱，那么你就要用极性很弱的溶液来洗脱你的目的蛋白
如果不行的话，说明有可能你的蛋白在柱子上有聚集或沉淀，你也可以尝试加点非极性表面活性剂洗脱一下。
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4楼2012-10-23 08:24:59
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+1, 解释得很清楚 2012-10-25 07:37:31
疏水柱是要高盐上样低盐洗脱。
所以最大的洗脱buffer就是水了。用水洗看看能不能洗出来。
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5楼2012-10-23 09:06:25
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zhangyehong

新虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by ynkuaile at 2012-10-22 17:03:39
你蛋白有辅酶或辅基吗？蛋白的颜色是辅酶或辅基的颜色吗？如果没有辅酶，那么换低盐溶液梯度洗脱，或换个低浓度的盐上样，或换个弱一点的疏水柱；如果有辅酶或辅基，那就是辅酶与蛋白分离了。实验顺利。

怎么知道蛋白有没有辅酶或辅基啊？  有颜色是因为之前过离子柱的时候有活性的成分都有颜色 所以就认为我要的酶也有颜色。
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6楼2012-10-24 19:55:46
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zhangyehong

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2012-10-22 18:17:29
用水洗用水洗用水洗用水洗

10%硫酸铵洗完之后 ，什么都洗不下来，最后只能用NaOH 才能洗掉
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7楼2012-10-24 19:57:47
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zhangyehong

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by yongbo_liang at 2012-10-23 08:24:59
如果没洗脱下来，就说明你的蛋白的极性很弱，那么你就要用极性很弱的溶液来洗脱你的目的蛋白
如果不行的话，说明有可能你的蛋白在柱子上有聚集或沉淀，你也可以尝试加点非极性表面活性剂洗脱一下。

我也想到了这个问题，我用的预装柱是苯基琼脂糖凝胶，结合力最强，我盐析的时候用的是30%的硫酸铵，所以疏水就用10%刚刚出现沉淀时候的浓度洗脱，但还是上完样之后都结合到了柱子上,那是不是再降低硫酸铵的浓度，这样就能减小蛋白和柱子的结合力？ 另外你说的非极性表面活性剂都有什么啊？
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8楼2012-10-24 20:08:59
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zhangyehong

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by dshlove at 2012-10-23 09:06:25
疏水柱是要高盐上样低盐洗脱。
所以最大的洗脱buffer就是水了。用水洗看看能不能洗出来。

就是水也洗不下来，最后只能用NaOH了
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9楼2012-10-24 20:09:48
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
看天: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-30 16:09:41
引用回帖:
9楼: Originally posted by zhangyehong at 2012-10-24 20:09:48
就是水也洗不下来，最后只能用NaOH了...

那就是你这根柱子时phenyl的结合能力太强了
你可以试试弱一点的。
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10楼2012-10-24 21:04:40
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