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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大片段PCR扩增求助
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serhhrr

铁虫 (初入文坛)

[求助] 大片段PCR扩增求助已有4人参与

我需要做一个RTPCR,扩增未知目的条带，大小约为3000bp，循环体系如下：94℃ 30s，54-60℃ 30s ， 72℃ 3-4min。酶的话用过LA Taq，Taq酶都用过，也换人操作过，可一直P不出来，求助各位高手！！
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1楼2013-10-23 15:50:04
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David勇

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by serhhrr at 2013-10-23 16:52:20
嗯，变性时间？这个我没试过，别的都改变过来，模板也换过几次都没用呢...

http://www.baidupcs.com/file/170 ... ;to=wb&fm=B,B,T,t&expires=8h&rt=pr&r=434070297&logid=3557013314&fn=A%20new%20protocol%20for%20highly%20efficient.pdf
这里有篇文章讲长链扩增的，用到两种酶混用。不知道对你有没有帮助。
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6楼2013-10-23 18:12:28
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David勇

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+2, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-10-23 17:33:27
你是不是在做RACE？我也在做这个觉得挺难的。不过看资料好像混用一种高效的酶和保真的酶会比较有效。不过LA taq很多人都选这个做也能做出来。有人建议减少变性时间会有效。
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2楼2013-10-23 16:04:49
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serhhrr

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by David勇 at 2013-10-23 16:04:49
你是不是在做RACE？我也在做这个觉得挺难的。不过看资料好像混用一种高效的酶和保真的酶会比较有效。不过LA taq很多人都选这个做也能做出来。有人建议减少变性时间会有效。

嗯，变性时间？这个我没试过，别的都改变过来，模板也换过几次都没用呢
赞一下 回复此楼
3楼2013-10-23 16:52:20
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taccycle

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-10-23 17:33:37
首先啊这个模板质量会严重影响你的实验，做这种实验请确保你有高质量的模板！！！！其次你可以把PCR体系放大，把模板量加大，把延伸时间放长，比如放到6min没有问题的
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用心
4楼2013-10-23 17:17:02
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