| 查看: 2656 | 回复: 14 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
[求助]
长片段连接问题
|
||
|
目前，正在做长片段的表达，但连接PBR322载体一直未能找到阳性克隆，现求助各位有经验的大神帮助。 我的目的片段已经连接到T载体上，目的片段6.5kb，双酶切后，跑电泳后很容易区分开来。但PBR322载体双酶切后一段长3.9kb左右，一段0.4kb。但载体双酶切后，取5微升跑胶发现，酶切不完全，酶切时间有将近4小时，但在回收胶上，根本分不开，所以切胶回收的话，肯定将单酶切产物和双酶切产物都回收了。在与目的片段连接16度过夜，挑选到的全是载体自连，根本发现不了阳性克隆。我觉得，即使含有单酶切的载体，（但是按之前跑胶的亮度来看，单酶切与双酶切的产物的亮度基本一致），也存在双酶切的产物与目的基因连接的概率，我的目的片段与载体的比例，做过1:3,1:5,1:8的不同浓度，那么现在我是不是应该采用分步酶切（采用酶自身所带的buffer），这样是不是可以优化到酶的最大活性，其中有一个酶切效果在通用buffer中活性也很高，我就怀疑是另外一个酶在通用buffer中，酶切活性低，而导致酶切的不完全？但是，这又回到了前面的问题，既然有那么多的双酶切产物也在其中，为什么我挑了多个克隆，怎么就完全是假阳性呢，另外，对于做过长片段的连接，有经验的前辈希望传授一下。 |
回复此楼» 猜你喜欢
0703化学调剂
已经有7人回复
-
0854，计算机类招收调剂
已经有6人回复
-
【0703化学调剂】-一志愿华中师范大学-六级475
已经有6人回复
-
0854可跨调剂，一作一项核心论文五项专利，省、国级证书40+数一英一287
已经有4人回复
-
能源材料化学课题组招收硕士研究生8-10名
已经有8人回复
-
0817 化学工程 299分求调剂 有科研经历 有二区文章
已经有3人回复
-
281求调剂（0805）
已经有11人回复
-
299求调剂
已经有5人回复
-
收复试调剂生
已经有3人回复
-
280求调剂
已经有7人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- PCR大片段问题
已经有15人回复
- 片段总是连不到T载体上
已经有22人回复
- DNA片段连接到载体上都有什么方法
已经有6人回复
- 2.7Kb的片段连接问题
已经有6人回复
- DNA片段化问题
已经有9人回复
- 两个基因片段的连接问题？
已经有11人回复
- PCR产物纯化后酶切，连接
已经有28人回复
- pET28a双酶切后连接目的基因，什么也不长。。。
已经有23人回复
- 单酶切的大片段连接转化及多个片段的连接转化问题
已经有8人回复
- 载体和酶切片段连接的问题
已经有5人回复
- 长片段连接问题
已经有12人回复
- 连接前等摩尔加入两个片段的问题
已经有6人回复
- 大片段连接问题
已经有20人回复
- 长片段DNA如何连接载体
已经有21人回复
- 回收片段连接以后为什么变短了？在线等
已经有6人回复
- 求助连接反应中的问题，谢谢!
已经有7人回复
- 【求助/交流】连接转化长菌有质粒，但是没有目的片段，怎么回事？？
已经有20人回复
- 【求助/交流】超大片段连接问题
已经有9人回复
- 【求助/交流】大片段连接转化成功与否问题
已经有11人回复
- 【求助/交流】长片段的连接转化
已经有9人回复
- 【求助/交流】关于PCR克隆片段连接问题
已经有4人回复
bullfrog325
木虫 (正式写手)
- BioEPI: 1
- 应助: 193 (高中生)
- 金币: 2880.3
- 散金: 200
- 红花: 24
- 帖子: 744
- 在线: 269.5小时
- 虫号: 1864929
- 注册: 2012-06-20
4楼2013-10-17 23:18:31
bullfrog325
木虫 (正式写手)
- BioEPI: 1
- 应助: 193 (高中生)
- 金币: 2880.3
- 散金: 200
- 红花: 24
- 帖子: 744
- 在线: 269.5小时
- 虫号: 1864929
- 注册: 2012-06-20
2楼2013-10-17 04:28:05
|
双酶切的体系：连接在T载体上的目的片段 20ul 10×buffer 5ul sal I 2ul NheI 2ul pdw 21ul 载体PBR322 25UL 10×buffer 5ul sal I 2ul NheI 2ul pdw 16ul 提取质粒跑电泳发现载体的条带明显比含有目的片段的载体暗，但由于实验室测量DNA的紫外分光光度计感觉测量的很不准确，碱裂解发提取的质粒浓度一般都显示达到4-5000ng/ul，双酶切电泳后发现目的片段很亮，但载体却不怎么亮。 谢谢您的回复。 我现在担心的一个问题是，是不是有这样一种情况，目的片段与载体连接过后，达到10.5kb,这会不会导致转化过程中出现问题，我直接转化到我的工程菌里面，自制的化学感受态，但既然能长出那么多载体自连，我觉得感受态应该没问题，还有就是长片段连接的时间一般多少为好？ |
3楼2013-10-17 22:34:25
5楼2013-10-18 10:02:41
