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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 长片段连接问题
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白色毛衣

银虫 (小有名气)

[求助] 长片段连接问题

目前，正在做长片段的表达，但连接PBR322载体一直未能找到阳性克隆，现求助各位有经验的大神帮助。
  我的目的片段已经连接到T载体上，目的片段6.5kb，双酶切后，跑电泳后很容易区分开来。但PBR322载体双酶切后一段长3.9kb左右，一段0.4kb。但载体双酶切后，取5微升跑胶发现，酶切不完全，酶切时间有将近4小时，但在回收胶上，根本分不开，所以切胶回收的话，肯定将单酶切产物和双酶切产物都回收了。在与目的片段连接16度过夜，挑选到的全是载体自连，根本发现不了阳性克隆。我觉得，即使含有单酶切的载体，（但是按之前跑胶的亮度来看，单酶切与双酶切的产物的亮度基本一致），也存在双酶切的产物与目的基因连接的概率，我的目的片段与载体的比例，做过1:3,1:5,1:8的不同浓度，那么现在我是不是应该采用分步酶切（采用酶自身所带的buffer），这样是不是可以优化到酶的最大活性，其中有一个酶切效果在通用buffer中活性也很高，我就怀疑是另外一个酶在通用buffer中，酶切活性低，而导致酶切的不完全？但是，这又回到了前面的问题，既然有那么多的双酶切产物也在其中，为什么我挑了多个克隆，怎么就完全是假阳性呢，另外，对于做过长片段的连接，有经验的前辈希望传授一下。
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1楼 2013-10-16 20:46:12
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白色毛衣

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 笑笑打dota at 2014-05-20 12:55:36
楼主，想问你一下你6.5k的目的片段连T载的体系是什么样的？我5.5k的片段连T载一直连不上

个人推荐是全式金的T5，这个载体有个好处是连不上的就不长，但长片段连接的效率一般会很低，我有时做只长一两个，但鉴定都是对的，只是偶尔有一两次会长很多
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10楼2014-05-22 09:25:52
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bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
酶切不完全一般会造成自连疯长的,我觉得倒不是因为单酶切产物容易连回去. 既然你都能发现明显的单酶切产物, 那么完整的质粒应该不少吧....
请给出你的反应体系信息(多少微克的质粒, 多少酶), 或许酶切不好是以为它们的量不太优化.
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2楼2013-10-17 04:28:05
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白色毛衣

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bullfrog325 at 2013-10-17 04:28:05
酶切不完全一般会造成自连疯长的,我觉得倒不是因为单酶切产物容易连回去. 既然你都能发现明显的单酶切产物, 那么完整的质粒应该不少吧....
请给出你的反应体系信息(多少微克的质粒, 多少酶), 或许酶切不好是以为它 ...

双酶切的体系：连接在T载体上的目的片段 20ul
                               10×buffer             5ul
                                sal I                     2ul
                                NheI                    2ul
                               pdw                     21ul


                     载体PBR322                 25UL
                           10×buffer                5ul
                            sal I                        2ul
                            NheI                       2ul
                            pdw                     16ul
提取质粒跑电泳发现载体的条带明显比含有目的片段的载体暗，但由于实验室测量DNA的紫外分光光度计感觉测量的很不准确，碱裂解发提取的质粒浓度一般都显示达到4-5000ng/ul，双酶切电泳后发现目的片段很亮，但载体却不怎么亮。
  谢谢您的回复。
         我现在担心的一个问题是，是不是有这样一种情况，目的片段与载体连接过后，达到10.5kb,这会不会导致转化过程中出现问题，我直接转化到我的工程菌里面，自制的化学感受态，但既然能长出那么多载体自连，我觉得感受态应该没问题，还有就是长片段连接的时间一般多少为好？
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3楼2013-10-17 22:34:25
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bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
白色毛衣: 金币+10 2013-10-18 10:00:29
不管载体测量准确与否, 我感觉酶切反应时加的载体多了, 楼主把载体的量减少到5微升吧.
我个人做连接时无论片段多大, 都是放室温20分钟, 用的是最普通的T4连接酶, 最长的载体我做过20K的, 一点问题没有.
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4楼2013-10-17 23:18:31
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白色毛衣

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by bullfrog325 at 2013-10-17 23:18:31
不管载体测量准确与否, 我感觉酶切反应时加的载体多了, 楼主把载体的量减少到5微升吧.
我个人做连接时无论片段多大, 都是放室温20分钟, 用的是最普通的T4连接酶, 最长的载体我做过20K的, 一点问题没有.

好的，谢谢，我试试
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5楼2013-10-18 10:02:41
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白色毛衣

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by bullfrog325 at 2013-10-17 23:18:31
不管载体测量准确与否, 我感觉酶切反应时加的载体多了, 楼主把载体的量减少到5微升吧.
我个人做连接时无论片段多大, 都是放室温20分钟, 用的是最普通的T4连接酶, 最长的载体我做过20K的, 一点问题没有.

今天做了将载体的量为5ul的，总体积为25ul的体系的预实验，结果依旧很不理想，酶的量为1ul。奇怪的一个现象的为原来做过10ul体系的预实验，加的是5ul的质粒，0.5的酶，用Nhe I酶自带的buffer，跑电泳发现单酶切效果不错，但是昨天做50ul的体系，采用分步酶切，第一步用Nhe I 酶切后用乙醇沉淀回收，二次酶切后用试剂盒回收，结果发现，却又没酶切完全，纠结。我现在是不是应该想办法尽可能的将单酶切产物和双酶切产物通过回收胶将其分离开来，提高胶的浓度，增加胶的长度，使相差400bp的两条带尽可能的分离开来，尽可能的少的回收双酶切产物。
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6楼2013-10-18 21:22:28
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xiaobai1999

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 白色毛衣 at 2013-10-17 22:34:25
双酶切的体系：连接在T载体上的目的片段 20ul
                               10×buffer             5ul
                                sal I                     2ul
                                 ...

5000ng/ul？我没看错吧？
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7楼2013-10-19 16:57:19
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笑笑打dota

金虫 (小有名气)
楼主，想问你一下你6.5k的目的片段连T载的体系是什么样的？我5.5k的片段连T载一直连不上
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8楼2014-05-20 12:55:36
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白色毛衣

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 笑笑打dota at 2014-05-20 12:55:36
楼主，想问你一下你6.5k的目的片段连T载的体系是什么样的？我5.5k的片段连T载一直连不上

你用的是什么T载体？
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9楼2014-05-22 09:22:23
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