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长片段连接问题
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目前，正在做长片段的表达，但连接PBR322载体一直未能找到阳性克隆，现求助各位有经验的大神帮助。 我的目的片段已经连接到T载体上，目的片段6.5kb，双酶切后，跑电泳后很容易区分开来。但PBR322载体双酶切后一段长3.9kb左右，一段0.4kb。但载体双酶切后，取5微升跑胶发现，酶切不完全，酶切时间有将近4小时，但在回收胶上，根本分不开，所以切胶回收的话，肯定将单酶切产物和双酶切产物都回收了。在与目的片段连接16度过夜，挑选到的全是载体自连，根本发现不了阳性克隆。我觉得，即使含有单酶切的载体，（但是按之前跑胶的亮度来看，单酶切与双酶切的产物的亮度基本一致），也存在双酶切的产物与目的基因连接的概率，我的目的片段与载体的比例，做过1:3,1:5,1:8的不同浓度，那么现在我是不是应该采用分步酶切（采用酶自身所带的buffer），这样是不是可以优化到酶的最大活性，其中有一个酶切效果在通用buffer中活性也很高，我就怀疑是另外一个酶在通用buffer中，酶切活性低，而导致酶切的不完全？但是，这又回到了前面的问题，既然有那么多的双酶切产物也在其中，为什么我挑了多个克隆，怎么就完全是假阳性呢，另外，对于做过长片段的连接，有经验的前辈希望传授一下。 |
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双酶切的体系：连接在T载体上的目的片段 20ul 10×buffer 5ul sal I 2ul NheI 2ul pdw 21ul 载体PBR322 25UL 10×buffer 5ul sal I 2ul NheI 2ul pdw 16ul 提取质粒跑电泳发现载体的条带明显比含有目的片段的载体暗，但由于实验室测量DNA的紫外分光光度计感觉测量的很不准确，碱裂解发提取的质粒浓度一般都显示达到4-5000ng/ul，双酶切电泳后发现目的片段很亮，但载体却不怎么亮。 谢谢您的回复。 我现在担心的一个问题是，是不是有这样一种情况，目的片段与载体连接过后，达到10.5kb,这会不会导致转化过程中出现问题，我直接转化到我的工程菌里面，自制的化学感受态，但既然能长出那么多载体自连，我觉得感受态应该没问题，还有就是长片段连接的时间一般多少为好？ |
3楼2013-10-17 22:34:25
bullfrog325
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