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candy845

木虫 (正式写手)

[求助] 关于pcr的几个问题，请教大家，先谢谢了！

我投的一篇文章外审意见回来了，实验中涉及到用realtime pcr 检测几个基因的相对定量变化，用ddct的方法，内参是GAPDH，编辑给了如下的意见：
1. There is no mention of any assessment of RNA quality, either of its integrity or purity (ie the absence of inhibition). 2. Furthermore, agains all well-published evidence, the authors use a single, unvalidated reference gene to normalise, showing quite marginal differences in mRNA levels in Figure 3. There is a huge body of literature that shows very clearly that this kind of analysis is misleading and inappropriate.
4. it has also been well-known since 1998, when ABI published the details of the DDCq method, that the PCR efficiencies of both genes of interest and reference genes must be known, as otherwise this method of analysis is invalid.

问题1是因为我怕文字太多而没写；
之后的问题就不懂了，我用的GAPDH在以往的研究中很常用啊？还有问题3也搞不懂了。问题4是要测扩增效率么？
请高手不吝赐教！谢谢。
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1楼2013-10-08 19:13:02
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DAX1

新虫 (小有名气)
★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-10-08 21:33:14
楼主你这投的是什么杂志，怎么竟然有这样的要求。实在太奇怪了。你总不能把你提出的RNA的OD值放在文章上吧，建议楼主可以搞个只给REVIEWER看。如果楼主做的是老鼠或者人的细胞，GAPDH肯定没问题啊，你可以ARGUE，当然同时你也做个ACTIN作对照的，这样既显示你的没问题，也显示你听从了他的意见。问题4应该就是扩增效率，仪器一般会给出吧。
总结出来，不知道楼主发的文章是不是检测pcr效率的，如果是一般的细胞分子生物学实验，这个REVIEWER的意见实在是不能理解。
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2楼2013-10-08 20:30:47
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candy845

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by DAX1 at 2013-10-08 20:30:47
楼主你这投的是什么杂志，怎么竟然有这样的要求。实在太奇怪了。你总不能把你提出的RNA的OD值放在文章上吧，建议楼主可以搞个只给REVIEWER看。如果楼主做的是老鼠或者人的细胞，GAPDH肯定没问题啊，你可以ARGUE，当 ...

是啊，我就是做的一般的生物学检测，用的小鼠的成骨细胞，方法什么的都是参照之前的文献，不知道为什么编辑会这么说，谢谢你的建议，准备完善pcr这段后解释一下。谢谢！
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3楼2013-10-09 15:46:22
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DAX1

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by candy845 at 2013-10-09 15:46:22
是啊，我就是做的一般的生物学检测，用的小鼠的成骨细胞，方法什么的都是参照之前的文献，不知道为什么编辑会这么说，谢谢你的建议，准备完善pcr这段后解释一下。谢谢！...

可能他也是没问题，然后就找点问题问问。这样挺好，至少没有叫你做啥高级的实验。祝好运
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4楼2013-10-09 16:13:52
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