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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 重组质粒酶切验证没有目的条带
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ashap

新虫 (初入文坛)

[求助] 重组质粒酶切验证没有目的条带

在构建慢病毒表达载体时，摇完菌提质粒酶切。在进行第二次酶切后，插入的目的条带电泳没有显示。这是为什么呢
本人构建完后提质粒先进行PCR验证过，扩增出了目的条带大小的片段，在第一步酶切时，电泳显示条带大小在10,000bp附近（我的载体为7.8kb, insert 为2250p）。后来分别用两个酶酶切后，大小也对。
我该如何解决第二部酶切的问题。

个人设想的是：
分别酶切+单酶切酶切产物PCR+重组质粒PCR+两步酶切后产物PCR=质粒构建成功。
不知可以不
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1楼 2013-10-07 20:05:03
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bioxixi

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by ashap at 2013-10-08 12:43:36
不能双酶切，那胶回收要达到怎样水平才能不影响后续酶切呢
...

根据经验，回收后跑胶，条带完整清晰就可以，毕竟每回收一次都会有损失
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8楼2013-10-11 11:10:50
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bioxixi

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
有没有试试双酶切？如果两个酶不能同时进行双酶切，那么可能是单酶切后回收的问题。
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2楼2013-10-08 09:01:09
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ashap

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bioxixi at 2013-10-08 09:01:09
有没有试试双酶切？如果两个酶不能同时进行双酶切，那么可能是单酶切后回收的问题。

不能双酶切，那胶回收要达到怎样水平才能不影响后续酶切呢

[ 发自小木虫客户端 ]
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3楼2013-10-08 12:43:36
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
直接测序不行吗？
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jiayoubashaonian
4楼2013-10-08 13:44:14
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