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ashap

新虫 (初入文坛)

[求助] 重组质粒酶切验证没有目的条带

在构建慢病毒表达载体时,摇完菌提质粒酶切。在进行第二次酶切后,插入的目的条带电泳没有显示。这是为什么呢
本人构建完后提质粒先进行PCR验证过,扩增出了目的条带大小的片段,在第一步酶切时,电泳显示条带大小在10,000bp附近(我的载体为7.8kb, insert 为2250p)。后来分别用两个酶酶切后,大小也对。
我该如何解决第二部酶切的问题。

个人设想的是:
分别酶切+单酶切酶切产物PCR+重组质粒PCR+两步酶切后产物PCR=质粒构建成功。
不知可以不
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

直接测序不行吗?
jiayoubashaonian
4楼2013-10-08 13:44:14
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bioxixi

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
有没有试试双酶切?如果两个酶不能同时进行双酶切,那么可能是单酶切后回收的问题。
2楼2013-10-08 09:01:09
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ashap

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by bioxixi at 2013-10-08 09:01:09
有没有试试双酶切?如果两个酶不能同时进行双酶切,那么可能是单酶切后回收的问题。

不能双酶切,那胶回收要达到怎样水平才能不影响后续酶切呢

[ 发自小木虫客户端 ]
3楼2013-10-08 12:43:36
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137167741

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
silicare: 金币+3, BioEPI+1, 应助指数+1 2013-10-09 13:50:37
第一、可以分步酶切
第二、分步酶切时,可以在中间加上让上一步酶失火的一步。
第三、可以分步酶切,切胶回收,这种情况是可以回收到的,本人验证过。
第四、可以使用快切酶,5分钟的那种。
总有一天我要修改用户名。
5楼2013-10-08 14:03:29
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