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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 荧光定量PCR
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浅笑包包

新虫 (小有名气)

[求助] 荧光定量PCR

荧光定量PCR的引物可以用来做一般的PCR吗？最近要做荧光定量，设计了荧光定量的引物，先提取RNA, 然后反转录成cDNA,就用荧光定量的引物来做一般的PCR,扩增一个基因，还做了一个不加模板的阴性对照，跑胶后发现对照与实验组的条带一样，可能是发生了引物二聚体的现象，是引物出问题了吗?不能用荧光定量的引物做一般的PCR,但是我导师说可以，求证？？、
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1楼 2013-09-14 13:11:47
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浅笑包包

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by hl16010921 at 2013-09-17 19:37:39
1.可以。扩增条件可以和定量相同。实际上有时为了省荧光染料，在摸realtimePCR条件时我们常常用realtime的引物用普通PCR摸条件。2.一般荧光定量引物的二聚体是最少的。因为realtimePCR要严格控制二聚体。3.阴性对照 ...

“realtime的引物是不行的，片段太短，有时甚至不是开放阅读框，没有酶切位点，没调节阅读框无法正确表达。”我做一般PCR的模板是反转录得到的cDNA，应该就不存在上述问题了吧，本来就是从RNA反转录过来的~
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7楼2013-09-18 08:17:06
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sageyaya

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-09-16 14:14:23
是可以的，但是比较麻烦，因为你要通过跑很多次找到一个对数期，如果按照平时的PCR的循环数，很有可能已经过了，已经在平台期了，而且增减很不明显。最好是做荧光定量PCR，方便简单。
另外不加模板的也有带，考虑一下是不是发生污染。
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2楼2013-09-16 13:55:50
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浅笑包包

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sageyaya at 2013-09-16 13:55:50
是可以的，但是比较麻烦，因为你要通过跑很多次找到一个对数期，如果按照平时的PCR的循环数，很有可能已经过了，已经在平台期了，而且增减很不明显。最好是做荧光定量PCR，方便简单。
另外不加模板的也有带，考虑一 ...

我的意思是我有荧光定量的引物，可以用这个引物来做一般的PCR吗？
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3楼2013-09-16 16:56:03
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sageyaya

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 浅笑包包 at 2013-09-16 16:56:03
我的意思是我有荧光定量的引物，可以用这个引物来做一般的PCR吗？...

你指的做一般的PCR是要割胶回收，连接什么的么？那是不行的，因为引物只是用来定量的，通常在300bp以内，并不是某个基因的全长，当然，如果的你的基因很短，这个引物已经能够P出来，应该可以吧，
如果是要通过PCR手段来进行定量是可以的。
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4楼2013-09-17 19:16:28
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