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浅笑包包

新虫 (小有名气)

[求助] 荧光定量PCR

荧光定量PCR的引物可以用来做一般的PCR吗？最近要做荧光定量，设计了荧光定量的引物，先提取RNA, 然后反转录成cDNA,就用荧光定量的引物来做一般的PCR,扩增一个基因，还做了一个不加模板的阴性对照，跑胶后发现对照与实验组的条带一样，可能是发生了引物二聚体的现象，是引物出问题了吗?不能用荧光定量的引物做一般的PCR,但是我导师说可以，求证？？、
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1楼 2013-09-14 13:11:47
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sageyaya

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-09-16 14:14:23
是可以的，但是比较麻烦，因为你要通过跑很多次找到一个对数期，如果按照平时的PCR的循环数，很有可能已经过了，已经在平台期了，而且增减很不明显。最好是做荧光定量PCR，方便简单。
另外不加模板的也有带，考虑一下是不是发生污染。
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2楼2013-09-16 13:55:50
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浅笑包包

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sageyaya at 2013-09-16 13:55:50
是可以的，但是比较麻烦，因为你要通过跑很多次找到一个对数期，如果按照平时的PCR的循环数，很有可能已经过了，已经在平台期了，而且增减很不明显。最好是做荧光定量PCR，方便简单。
另外不加模板的也有带，考虑一 ...

我的意思是我有荧光定量的引物，可以用这个引物来做一般的PCR吗？
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3楼2013-09-16 16:56:03
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sageyaya

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 浅笑包包 at 2013-09-16 16:56:03
我的意思是我有荧光定量的引物，可以用这个引物来做一般的PCR吗？...

你指的做一般的PCR是要割胶回收，连接什么的么？那是不行的，因为引物只是用来定量的，通常在300bp以内，并不是某个基因的全长，当然，如果的你的基因很短，这个引物已经能够P出来，应该可以吧，
如果是要通过PCR手段来进行定量是可以的。
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4楼2013-09-17 19:16:28
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hl16010921

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
浅笑包包: 金币+5, ★★★很有帮助, 三克油~受教啦~~ 2013-09-18 07:48:38
1.可以。扩增条件可以和定量相同。实际上有时为了省荧光染料，在摸realtimePCR条件时我们常常用realtime的引物用普通PCR摸条件。2.一般荧光定量引物的二聚体是最少的。因为realtimePCR要严格控制二聚体。3.阴性对照出结果，可能是出现了污染。二聚体和目的条带从电泳上一般能分辨出来。二聚体都低于100bp，亮度大，有弥散。realtimePCR的目的序列一般都设计成100~150bp，最长不超过300bp。不建议设计100bp以下的片段，太难和引物二聚体区分了。4.普通PCR的目的是什么？得到目的片段然后进行克隆，realtime的引物是不行的，片段太短，有时甚至不是开放阅读框，没有酶切位点，没调节阅读框无法正确表达。补充半定量的电泳结果是可以的，可以选realtimePCR对数期最大的循环做普通PCR，电泳，软件分析图像。
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5楼2013-09-17 19:37:39
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浅笑包包

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by sageyaya at 2013-09-17 19:16:28
你指的做一般的PCR是要割胶回收，连接什么的么？那是不行的，因为引物只是用来定量的，通常在300bp以内，并不是某个基因的全长，当然，如果的你的基因很短，这个引物已经能够P出来，应该可以吧，
如果是要通过PCR ...

是用来验证反转录有没有成功，不是为了割胶回收和链接~
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6楼2013-09-18 07:48:17
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浅笑包包

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by hl16010921 at 2013-09-17 19:37:39
1.可以。扩增条件可以和定量相同。实际上有时为了省荧光染料，在摸realtimePCR条件时我们常常用realtime的引物用普通PCR摸条件。2.一般荧光定量引物的二聚体是最少的。因为realtimePCR要严格控制二聚体。3.阴性对照 ...

“realtime的引物是不行的，片段太短，有时甚至不是开放阅读框，没有酶切位点，没调节阅读框无法正确表达。”我做一般PCR的模板是反转录得到的cDNA，应该就不存在上述问题了吧，本来就是从RNA反转录过来的~
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7楼2013-09-18 08:17:06
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hl16010921

木虫 (正式写手)
1.终止密码到aaaaaaaaaaaa是有距离的。有时引物会设计到该区域。2.表达的会在引物中引入酶切位点，并调整阅读框，使翻译正常。这样引物不是100%和模板匹配的。3.设计realtime引物时一般会在内含子和外显子交界处设计，或在两个内含子上设计，以区别基因组扩增产物和cDNA的PCR产物。防止微量的DNA污染引起的影响。
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8楼2013-09-18 08:32:27
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