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浅笑包包新虫 (小有名气)
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[求助]
荧光定量PCR
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| 荧光定量PCR的引物可以用来做一般的PCR吗？最近要做荧光定量，设计了荧光定量的引物，先提取RNA, 然后反转录成cDNA,就用荧光定量的引物来做一般的PCR,扩增一个基因，还做了一个不加模板的阴性对照，跑胶后发现对照与实验组的条带一样，可能是发生了引物二聚体的现象，是引物出问题了吗?不能用荧光定量的引物做一般的PCR,但是我导师说可以，求证？？、 |
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4楼2013-09-17 19:16:28
2楼2013-09-16 13:55:50
浅笑包包
新虫 (小有名气)
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3楼2013-09-16 16:56:03
hl16010921
木虫 (正式写手)
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
浅笑包包: 金币+5, ★★★很有帮助, 三克油~受教啦~~ 2013-09-18 07:48:38
浅笑包包: 金币+5, ★★★很有帮助, 三克油~受教啦~~ 2013-09-18 07:48:38
| 1.可以。扩增条件可以和定量相同。实际上有时为了省荧光染料，在摸realtimePCR条件时我们常常用realtime的引物用普通PCR摸条件。2.一般荧光定量引物的二聚体是最少的。因为realtimePCR要严格控制二聚体。3.阴性对照出结果，可能是出现了污染。二聚体和目的条带从电泳上一般能分辨出来。二聚体都低于100bp，亮度大，有弥散。realtimePCR的目的序列一般都设计成100~150bp，最长不超过300bp。不建议设计100bp以下的片段，太难和引物二聚体区分了。4.普通PCR的目的是什么？得到目的片段然后进行克隆，realtime的引物是不行的，片段太短，有时甚至不是开放阅读框，没有酶切位点，没调节阅读框无法正确表达。补充半定量的电泳结果是可以的，可以选realtimePCR对数期最大的循环做普通PCR，电泳，软件分析图像。 |
5楼2013-09-17 19:37:39
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