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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助！！蛋白的提取与纯化
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崔t-o-p

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助！！蛋白的提取与纯化

大家好，我做的是一个细菌毒力蛋白的功能研究，这个毒力蛋白从细菌本身不好分离（目的蛋白含量太低）。于是，将其完整表达出来并连接至pET32a上，进行原核表达。表达的融合蛋白以上清的可溶性形式进行后续试验。该毒力蛋白约220KDa，是菌体的分泌蛋白，原核表达产量不高，现在上清中的含量也很低，怎么纯化是个大问题，
    请问大家有什么好的纯化方法，亦或是好的分离该毒力蛋白的有效方法！ 跪谢大家！！急急急
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1楼 2013-09-13 09:09:34
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RUI1990

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-09-13 22:20:15
该目的蛋白应该有蛋白标签吧，亲和层析的方法不行吗？
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做自己
2楼2013-09-13 16:06:18
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欧阳-90

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
崔t-o-p: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-09-13 18:01:30
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-13 22:20:21
蛋白含量很低你是怎么判断的呢？只看目的条带的大小吗？或者是做了WB验证？如果是WB验证有你的目的蛋白，只是含量很低，你可以选择先硫酸铵富集该蛋白，在后期处理。
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3楼2013-09-13 16:11:36
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崔t-o-p

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 欧阳-90 at 2013-09-13 16:11:36
蛋白含量很低你是怎么判断的呢？只看目的条带的大小吗？或者是做了WB验证？如果是WB验证有你的目的蛋白，只是含量很低，你可以选择先硫酸铵富集该蛋白，在后期处理。

就是跑PAGE,看目的条带大小的，我想请问你原核表达的融合蛋白，先破碎之后上清用硫酸铵沉淀富积，这个方法可行吗？
  我之前尝试过破碎后，目的蛋白在沉淀里，上清几乎很少。我的目的是需要有活性的蛋白，越纯越好。。。
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4楼2013-09-13 18:08:56
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崔t-o-p

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by RUI1990 at 2013-09-13 16:06:18
该目的蛋白应该有蛋白标签吧，亲和层析的方法不行吗？

因为含量太少了，根本纯化不成。。。
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5楼2013-09-13 21:37:57
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木_塚

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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崔t-o-p: 金币+5, ★有帮助 2013-09-18 09:51:09
得到该蛋白的基因，将其拼接在强启动子下，使其overexpress，然后在用层析就好了。
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不作就不会死！
6楼2013-09-13 23:55:01
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feilinshiji

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以用蛋白纯化仪试试
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7楼2013-09-16 08:44:51
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崔t-o-p

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by feilinshiji at 2013-09-16 08:44:51
可以用蛋白纯化仪试试

专门的仪器吗？我们这里还没有。。。
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8楼2013-09-16 11:52:24
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feilinshiji

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by 崔t-o-p at 2013-09-16 11:52:24
专门的仪器吗？我们这里还没有。。。...

你可以打听一下，有些公共平台试验室有这个东西
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9楼2013-09-16 14:24:06
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zc10052157

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

毒蛋白好像是用rossetta菌做
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hold住
10楼2013-09-16 16:00:02
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