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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 【资料】植物总蛋白提取方法
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xjtuwgz

金虫 (正式写手)

[资源] 【资料】植物总蛋白提取方法

一提取植物总蛋白（以植物花粉为例）：
1.三氯乙酸法（TCA）/丙酮(acetone)提取花粉总蛋白质
花粉在liquid nitrogen中研磨成粉末，用含10%TCA和1%DTT的acetone沉淀蛋白质，-20度 2个小时(必要时过夜)，4度 25000g离心20min后去上清，用含1%DTT的acetone溶液悬浮沉淀，-20度 1个小时,再次离心去上清，将真空干燥的沉淀在等电聚焦缓冲液中(8M urea，20mmDTT,4%CHAPS,2%ampholyte,PH:3-10) 20度震荡1小时，20度25000g离心20min，收集上清，沉淀再次用IEF缓冲液离心收集上清，可为后续试验做准备。

2．苯酚（phenol）提取法
花粉在liquid nitrogen中研磨成粉末，添加1ml的phenol（tris 8.8 缓冲液）继续研磨5min,加提取缓冲液（0.1mol/L 8.8 Tr i s –HCl，5mmEDTA,20mmDTT,30%sucrose）。将样本转移至离心管中，4度 震荡30min，25000g离心10min，将上层的phenol层转移进另一个试管，将下边的水相层加1ml的phenol（tris 8.8 缓冲液）及提取缓冲液，震荡，离心，将再次收集到的phenol与前边收集的混合，加5倍体积的0.1 M ammonium acetate in 100%methanol，在-20度震荡沉淀蛋白质，必要时过夜，4度  25000g离心10min，将沉淀用0.1 M ammonium acetate in 100%methanol及80% acetone各洗两次, 含10mmDTT的80% acetone再洗一次，在每一步中蛋白沉淀都要完全重悬— -20度震荡30min，4度  25000g离心20min，洗剂完成后，沉淀真空干燥，IEF buffer提取蛋白质，如方法1。

3．直接IEF buffer提取蛋白质
直接IEF buffer提取蛋白质，花粉在liquid nitrogen中研磨成粉末，然后加入IEF buffer(8M尿素，20mmDTT,4%CHAPS，5mmEDTA，5mmTris base,2%ampholyte,PH:3-10).如方法1。

4．Tris-HCL缓冲液法
花粉在liquid nitrogen中研磨成粉末，加入Tris-HCL缓冲液（50mm,8.8,Tris-HCL, 5mmEDTA,20mmDTT,100mmKCL,2mmPMSF）,在融化后，混合液在4度放30min, 25000g离心20min,收集上清，对沉淀重新提取一次，将收集到的上清混合，用5倍体积的100%丙酮沉淀蛋白质，-20度孵育2h,离心后，用80%的丙酮洗剂沉淀2次，IEF buffer重悬沉淀，方法如1
  5．利用Bradford试剂法估测提取的总蛋白浓度，并调整浓度行蛋白电泳，-80度保存。
本人翻译的，具体方法流程见附件原文。[ Last edited by xjtuwgz on 2011-9-28 at 17:24 ]

·

[ Last edited by silicare on 2012-11-6 at 07:52 ]
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1楼 2011-09-28 12:58:32
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linyingjia

至尊木虫 (职业作家)

★★★ 三星级,支持鼓励

引用回帖:
1楼: Originally posted by xjtuwgz at 2011-09-28 12:58:32:
一提取植物总蛋白（以植物花粉为例）：
1.三氯乙酸法（TCA）/丙酮(acetone)提取花粉总蛋白质
花粉在liquid nitrogen中研磨成粉末，用含10%TCA和1%DTT的acetone沉淀蛋白质，-200C 2个小时(必要时过夜)，40C 2500 ...

-80度   不是-800c
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2楼2011-09-28 13:16:28
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jinhx87

至尊木虫 (知名作家)

★★★★★ 五星级,优秀推荐

ding
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3楼2011-09-28 14:12:22
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xjtuwgz

金虫 (正式写手)
引用回帖:
1楼: Originally posted by xjtuwgz at 2011-09-28 12:58:32:
一提取植物总蛋白（以植物花粉为例）：
1.三氯乙酸法（TCA）/丙酮(acetone)提取花粉总蛋白质
花粉在liquid nitrogen中研磨成粉末，用含10%TCA和1%DTT的acetone沉淀蛋白质，-20度 2个小时(必要时过夜)，4度 2500 ...

不好意思，这个东西做过好长时间了啊，在word中显示好着呢，直接COPY过来的没有仔细看，现已修改。
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4楼2011-09-28 17:26:30
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yiriyoltu

木虫 (著名写手)

★★★★★ 五星级,优秀推荐

very good .
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5楼2011-09-28 23:18:22
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香菱儿

铁杆木虫 (著名写手)

★★★★★ 五星级,优秀推荐

Thanks!
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6楼2011-09-29 11:41:43
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jimmyp

铁虫 (小有名气)

★★★★★ 五星级,优秀推荐

狂顶
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11楼2012-02-18 19:15:10
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qixi726

铜虫 (初入文坛)

★★★★★ 五星级,优秀推荐

顶下！
谢谢共享！
我这也有一些此类实验方法的总结经验啥的！

http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=4197411&fpage=1

这里我帖子里面推荐的这个实验方法网站就挺不错，也推荐给楼主！
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14楼2012-03-04 17:04:30
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xjtuwgz

金虫 (正式写手)
呵呵，谢谢，不过这个链接打不开啊。
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15楼2012-03-04 18:19:31
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xjtuwgz

金虫 (正式写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by qixi726 at 2012-03-04 17:04:30:
顶下！
谢谢共享！
我这也有一些此类实验方法的总结经验啥的！

http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=4197411&fpage=1

这里我帖子里面推荐的这个实验方法网站就挺不错，也推荐给楼主！

呵呵，谢谢，不过这个链接打不开啊。
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16楼2012-03-04 18:20:03
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知行

新虫 (初入文坛)
非常感谢
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26楼2012-11-28 10:30:03
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匿名

用户注销 (小有名气)
本帖仅楼主可见
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29楼2013-09-12 21:30:39
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xjtuwgz

金虫 (正式写手)
引用回帖:
29楼: Originally posted by 刘勇男 at 2013-09-12 21:30:39
顶一下，感谢分享！
小生新手，蛋白提取步骤原理和药品作用不懂，有没有这方面的知识介绍资料呢，谢谢分享下

不好意思，我现在做过这个实验很久了啊，我记得在我传的资料里有相关介绍啊，没有就百度下吧，呵呵，不好意思了。
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30楼2013-09-12 21:54:55
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wujun_2008

新虫 (初入文坛)
谢谢楼主的辛苦劳动
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42楼2014-06-23 12:05:23
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广中医彭

铜虫 (小有名气)

★★★★★ 五星级,优秀推荐

感谢分享，非常有用，辛苦了！
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48楼2014-08-13 11:35:14
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sunjiutong7楼
2011-12-18 21:45   回复  
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sunjiutong8楼
2011-12-18 21:49   回复  
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diliu.2019楼
2011-12-18 22:22   回复  
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周世龙10楼
2012-02-15 08:36   回复  
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starking52112楼
2012-03-04 16:24   回复  
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starking52113楼
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wei/wei17楼
2012-03-12 01:03   回复  
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clover515618楼
2012-04-28 10:11   回复  
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西窗-看月19楼
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boya88820楼
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jiaoguan21楼
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109354258524楼
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2012-11-28 10:06   回复  
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bill396726427楼
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