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xjtuwgz

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[资源] 【资料】植物总蛋白提取方法

一提取植物总蛋白（以植物花粉为例）：
1.三氯乙酸法（TCA）/丙酮(acetone)提取花粉总蛋白质
花粉在liquid nitrogen中研磨成粉末，用含10%TCA和1%DTT的acetone沉淀蛋白质，-20度 2个小时(必要时过夜)，4度 25000g离心20min后去上清，用含1%DTT的acetone溶液悬浮沉淀，-20度 1个小时,再次离心去上清，将真空干燥的沉淀在等电聚焦缓冲液中(8M urea，20mmDTT,4%CHAPS,2%ampholyte,PH:3-10) 20度震荡1小时，20度25000g离心20min，收集上清，沉淀再次用IEF缓冲液离心收集上清，可为后续试验做准备。

2．苯酚（phenol）提取法
花粉在liquid nitrogen中研磨成粉末，添加1ml的phenol（tris 8.8 缓冲液）继续研磨5min,加提取缓冲液（0.1mol/L 8.8 Tr i s –HCl，5mmEDTA,20mmDTT,30%sucrose）。将样本转移至离心管中，4度震荡30min，25000g离心10min，将上层的phenol层转移进另一个试管，将下边的水相层加1ml的phenol（tris 8.8 缓冲液）及提取缓冲液，震荡，离心，将再次收集到的phenol与前边收集的混合，加5倍体积的0.1 M ammonium acetate in 100%methanol，在-20度震荡沉淀蛋白质，必要时过夜，4度 25000g离心10min，将沉淀用0.1 M ammonium acetate in 100%methanol及80% acetone各洗两次, 含10mmDTT的80% acetone再洗一次，在每一步中蛋白沉淀都要完全重悬— -20度震荡30min，4度 25000g离心20min，洗剂完成后，沉淀真空干燥，IEF buffer提取蛋白质，如方法1。

3．直接IEF buffer提取蛋白质
直接IEF buffer提取蛋白质，花粉在liquid nitrogen中研磨成粉末，然后加入IEF buffer(8M尿素，20mmDTT,4%CHAPS，5mmEDTA，5mmTris base,2%ampholyte,PH:3-10).如方法1。

4．Tris-HCL缓冲液法
花粉在liquid nitrogen中研磨成粉末，加入Tris-HCL缓冲液（50mm,8.8,Tris-HCL, 5mmEDTA,20mmDTT,100mmKCL,2mmPMSF）,在融化后，混合液在4度放30min, 25000g离心20min,收集上清，对沉淀重新提取一次，将收集到的上清混合，用5倍体积的100%丙酮沉淀蛋白质，-20度孵育2h,离心后，用80%的丙酮洗剂沉淀2次，IEF buffer重悬沉淀，方法如1
5．利用Bradford试剂法估测提取的总蛋白浓度，并调整浓度行蛋白电泳，-80度保存。
本人翻译的，具体方法流程见附件原文。[ Last edited by xjtuwgz on 2011-9-28 at 17:24 ]

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[ Last edited by silicare on 2012-11-6 at 07:52 ]

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1楼 2011-09-28 12:58:32

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匿名

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29楼2013-09-12 21:30:39

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linyingjia

至尊木虫 (职业作家)

★★★ 三星级,支持鼓励

引用回帖:

1楼: Originally posted by xjtuwgz at 2011-09-28 12:58:32:
一提取植物总蛋白（以植物花粉为例）：
1.三氯乙酸法（TCA）/丙酮(acetone)提取花粉总蛋白质
花粉在liquid nitrogen中研磨成粉末，用含10%TCA和1%DTT的acetone沉淀蛋白质，-200C 2个小时(必要时过夜)，40C 2500 ...

-80度不是-800c

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2楼2011-09-28 13:16:28

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