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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助！！蛋白的提取与纯化
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欧阳-90

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 崔t-o-p at 2013-09-13 18:08:56
就是跑PAGE,看目的条带大小的，我想请问你原核表达的融合蛋白，先破碎之后上清用硫酸铵沉淀富积，这个方法可行吗？
  我之前尝试过破碎后，目的蛋白在沉淀里，上清几乎很少。我的目的是需要有活性的蛋白，越纯越好 ...

第一：只凭PAGE条带大小确定目的蛋白不准确，因为我遇见过很多次。除非是能做对照，看到条带粗细有明显变化。
第二：破碎之后用硫酸铵富集我做过比较少。但是有一个蛋白我就是这样做的。虽然是重组蛋白，但是我那个蛋白没有标签，是用硫酸铵富集后再过离子交换的。
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11楼2013-09-17 14:04:06
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同东中郎将

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

220KD蛋白分子偏大，不建议用原核表达体系做，就算表达了也是包涵体的可能性比较大。
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曾子曰：“士不可以不弘毅，任重而道远。仁以为己任，不亦重乎？死而后已，不亦远乎？”
12楼2013-09-17 14:24:00
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zhangbighui

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你先要提高蛋白产量后再进行纯化，目的蛋白产量不高无论怎么样的纯化方法产率都不高，而且杂蛋白会很高。毒蛋白就会对细胞有毒性吧，你可以看看PET表达手册，找一个可以高产可溶毒蛋白的表达菌。然后进行表达优化，最后进行亲和纯化。
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成功，就是成为你想成为的人
13楼2013-09-17 15:17:23
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崔t-o-p

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 木_塚 at 2013-09-13 23:55:01
得到该蛋白的基因，将其拼接在强启动子下，使其overexpress，然后在用层析就好了。

你好，请问过表达是不是专门用过表达的载体？过表达只能在真核细胞转染上利用吗？这方面我没有接触过，还请你帮忙解释一下。。。万分感谢
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14楼2013-09-18 09:50:56
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