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欧阳-90

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 崔t-o-p at 2013-09-13 18:08:56
就是跑PAGE,看目的条带大小的,我想请问你原核表达的融合蛋白,先破碎之后上清用硫酸铵沉淀富积,这个方法可行吗?
  我之前尝试过破碎后,目的蛋白在沉淀里,上清几乎很少。我的目的是需要有活性的蛋白,越纯越好 ...

第一:只凭PAGE条带大小确定目的蛋白不准确,因为我遇见过很多次。除非是能做对照,看到条带粗细有明显变化。
第二:破碎之后用硫酸铵富集我做过比较少。但是有一个蛋白我就是这样做的。虽然是重组蛋白,但是我那个蛋白没有标签,是用硫酸铵富集后再过离子交换的。
11楼2013-09-17 14:04:06
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同东中郎将

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

220KD蛋白分子偏大,不建议用原核表达体系做,就算表达了也是包涵体的可能性比较大。
曾子曰:“士不可以不弘毅,任重而道远。仁以为己任,不亦重乎?死而后已,不亦远乎?”
12楼2013-09-17 14:24:00
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zhangbighui

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你先要提高蛋白产量后再进行纯化,目的蛋白产量不高无论怎么样的纯化方法产率都不高,而且杂蛋白会很高。毒蛋白就会对细胞有毒性吧,你可以看看PET表达手册,找一个可以高产可溶毒蛋白的表达菌。然后进行表达优化,最后进行亲和纯化。
成功,就是成为你想成为的人
13楼2013-09-17 15:17:23
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崔t-o-p

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 木_塚 at 2013-09-13 23:55:01
得到该蛋白的基因,将其拼接在强启动子下,使其overexpress,然后在用层析就好了。

你好,请问过表达是不是专门用过表达的载体?过表达只能在真核细胞转染上利用吗?这方面我没有接触过,还请你帮忙解释一下。。。万分感谢
14楼2013-09-18 09:50:56
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