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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助！！蛋白的提取与纯化
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崔t-o-p

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助！！蛋白的提取与纯化

大家好，我做的是一个细菌毒力蛋白的功能研究，这个毒力蛋白从细菌本身不好分离（目的蛋白含量太低）。于是，将其完整表达出来并连接至pET32a上，进行原核表达。表达的融合蛋白以上清的可溶性形式进行后续试验。该毒力蛋白约220KDa，是菌体的分泌蛋白，原核表达产量不高，现在上清中的含量也很低，怎么纯化是个大问题，
    请问大家有什么好的纯化方法，亦或是好的分离该毒力蛋白的有效方法！ 跪谢大家！！急急急
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1楼 2013-09-13 09:09:34
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zhangbighui

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你先要提高蛋白产量后再进行纯化，目的蛋白产量不高无论怎么样的纯化方法产率都不高，而且杂蛋白会很高。毒蛋白就会对细胞有毒性吧，你可以看看PET表达手册，找一个可以高产可溶毒蛋白的表达菌。然后进行表达优化，最后进行亲和纯化。
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成功，就是成为你想成为的人
13楼2013-09-17 15:17:23
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RUI1990

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-09-13 22:20:15
该目的蛋白应该有蛋白标签吧，亲和层析的方法不行吗？
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做自己
2楼2013-09-13 16:06:18
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欧阳-90

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
崔t-o-p: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-09-13 18:01:30
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-13 22:20:21
蛋白含量很低你是怎么判断的呢？只看目的条带的大小吗？或者是做了WB验证？如果是WB验证有你的目的蛋白，只是含量很低，你可以选择先硫酸铵富集该蛋白，在后期处理。
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3楼2013-09-13 16:11:36
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崔t-o-p

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 欧阳-90 at 2013-09-13 16:11:36
蛋白含量很低你是怎么判断的呢？只看目的条带的大小吗？或者是做了WB验证？如果是WB验证有你的目的蛋白，只是含量很低，你可以选择先硫酸铵富集该蛋白，在后期处理。

就是跑PAGE,看目的条带大小的，我想请问你原核表达的融合蛋白，先破碎之后上清用硫酸铵沉淀富积，这个方法可行吗？
  我之前尝试过破碎后，目的蛋白在沉淀里，上清几乎很少。我的目的是需要有活性的蛋白，越纯越好。。。
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4楼2013-09-13 18:08:56
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