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崔t-o-p

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助!!蛋白的提取与纯化

大家好,我做的是一个细菌毒力蛋白的功能研究,这个毒力蛋白从细菌本身不好分离(目的蛋白含量太低)。于是,将其完整表达出来并连接至pET32a上,进行原核表达。表达的融合蛋白以上清的可溶性形式进行后续试验。该毒力蛋白约220KDa,是菌体的分泌蛋白,原核表达产量不高,现在上清中的含量也很低,怎么纯化是个大问题,
    请问大家有什么好的纯化方法,亦或是好的分离该毒力蛋白的有效方法! 跪谢大家!!急急急
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木_塚

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
崔t-o-p: 金币+5, 有帮助 2013-09-18 09:51:09
得到该蛋白的基因,将其拼接在强启动子下,使其overexpress,然后在用层析就好了。
不作就不会死!
6楼2013-09-13 23:55:01
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RUI1990

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流! 2013-09-13 22:20:15
该目的蛋白应该有蛋白标签吧,亲和层析的方法不行吗?
做自己
2楼2013-09-13 16:06:18
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欧阳-90

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
崔t-o-p: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-09-13 18:01:30
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2013-09-13 22:20:21
蛋白含量很低你是怎么判断的呢?只看目的条带的大小吗?或者是做了WB验证?如果是WB验证有你的目的蛋白,只是含量很低,你可以选择先硫酸铵富集该蛋白,在后期处理。
3楼2013-09-13 16:11:36
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崔t-o-p

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 欧阳-90 at 2013-09-13 16:11:36
蛋白含量很低你是怎么判断的呢?只看目的条带的大小吗?或者是做了WB验证?如果是WB验证有你的目的蛋白,只是含量很低,你可以选择先硫酸铵富集该蛋白,在后期处理。

就是跑PAGE,看目的条带大小的,我想请问你原核表达的融合蛋白,先破碎之后上清用硫酸铵沉淀富积,这个方法可行吗?
  我之前尝试过破碎后,目的蛋白在沉淀里,上清几乎很少。我的目的是需要有活性的蛋白,越纯越好。。。
4楼2013-09-13 18:08:56
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