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ufowjing

银虫 (小有名气)

[求助] 【求助】 SDS-PAGE

电泳结果一直是只有两三个个条带可见，跑的是斑马鱼匀浆，用的是匀浆管手动匀浆，用的PBS做匀浆介质，同一块胶跑的小鼠肝脏匀浆条带很多。希望大家帮忙分析下原因，是不是样品提取的问题。提取的蛋白量不够？
【求助】 SDS-PAGE
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1楼2013-08-26 19:38:44
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ufowjing

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 跳舞的骆驼 at 2013-08-26 21:22:32
这个看着好像提蛋白的过程中丢失了许多小分子的蛋白，可能是匀浆不充分，另外同学光匀浆是不够的，要加裂解液，最好加一步超生裂解。加油！

谢谢您的解答，能给我具体介绍一下吗？
像裂解液和PMSF买哪个牌子的效果比较好？
裂解液和PMSF的用量，匀浆的时候加裂解液和PMSF还需要再加PBS吗？具体配比和顺序是怎样的？
还有超声条件的设置
刚接触电泳实验，不懂的很多问题有点多，麻烦您啦
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6楼2013-08-27 18:58:21
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跳舞的骆驼

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖应助！ 2013-08-26 22:07:40
这个看着好像提蛋白的过程中丢失了许多小分子的蛋白，可能是匀浆不充分，另外同学光匀浆是不够的，要加裂解液，最好加一步超生裂解。加油！
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2楼2013-08-26 21:22:32
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1.好像电泳带的拖尾比较严重。样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。
处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂（表面活性剂增容）；电泳缓冲液时间可能过长。
2.蛋白质样品是否存在降解？或者样品纯化时丢失了不少蛋白质。包括未使用样品促溶剂（表面活性剂增容）导致了蛋白质样品丢失；
3.样品也似未浓缩好。应适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7）；适当降低电压。
4.缓冲溶液是不是有问题？或者防止太久。
制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris－HCL系统，TEMED与AP：AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基硫酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。
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3楼2013-08-26 23:34:53
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ritchiejin

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ufowjing: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2013-08-27 18:52:53
首先，小鼠肝脏匀浆中的杂质（如脂类，多糖等）要比整条的斑马鱼少得多。所以，同样的处理方法，在斑马鱼蛋白提取中效果会不好。
其次，蛋白条带拖尾和弥散也同样是因为杂质没有去除干净。但是从marker的条带看，胶应该没有大的问题。
动物全蛋白提取的话，个人认为只用PBS是不够的，PBS的pH缓冲范围有限，有些蛋白不容易溶解进入，可能随着你离心就沉淀下来了。建议你能使用丙酮沉淀法，既能除去大部分杂质，也能够除盐。虽然一些蛋白可能会丢失，但是会比PBS匀浆的方法提取的蛋白要多。另外，我们提蛋白都是用液氮冷冻研钵研磨，再加入蛋白裂解液超声的。你可以试一试。
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4楼2013-08-27 10:05:09
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