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电泳结果一直是只有两三个个条带可见，跑的是斑马鱼匀浆，用的是匀浆管手动匀浆，用的PBS做匀浆介质，同一块胶跑的小鼠肝脏匀浆条带很多。希望大家帮忙分析下原因，是不是样品提取的问题。提取的蛋白量不够？ DSC01062.JPG |
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 蛋白质生物学实验经验 |
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2楼2013-08-26 21:22:32
凌波丽
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【答案】应助回帖
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1.好像电泳带的拖尾比较严重。样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。 处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂（表面活性剂增容）；电泳缓冲液时间可能过长。 2.蛋白质样品是否存在降解？或者样品纯化时丢失了不少蛋白质。包括未使用样品促溶剂（表面活性剂增容）导致了蛋白质样品丢失； 3.样品也似未浓缩好。应适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7）；适当降低电压。 4.缓冲溶液是不是有问题？或者防止太久。 制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris－HCL系统，TEMED与AP：AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基硫酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。 |
3楼2013-08-26 23:34:53
ritchiejin
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【答案】应助回帖
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首先，小鼠肝脏匀浆中的杂质（如脂类，多糖等）要比整条的斑马鱼少得多。所以，同样的处理方法，在斑马鱼蛋白提取中效果会不好。 其次，蛋白条带拖尾和弥散也同样是因为杂质没有去除干净。但是从marker的条带看，胶应该没有大的问题。 动物全蛋白提取的话，个人认为只用PBS是不够的，PBS的pH缓冲范围有限，有些蛋白不容易溶解进入，可能随着你离心就沉淀下来了。建议你能使用丙酮沉淀法，既能除去大部分杂质，也能够除盐。虽然一些蛋白可能会丢失，但是会比PBS匀浆的方法提取的蛋白要多。另外，我们提蛋白都是用液氮冷冻研钵研磨，再加入蛋白裂解液超声的。你可以试一试。 |
4楼2013-08-27 10:05:09
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谢谢您的解答，我看到一个方法是说： 肝每50mg加（裂解液）0.5mlRIPA和5uLPMSF（不能预先加入，否则失效） 手动或电动匀浆。注意保持低温（埋在冰中），快速匀浆。 将样品转移到1.5ml离心管中，12000g离心，4℃，2-3min。 是按照这种操作步骤吗？那是否还需要PBS？ 裂解液是用RIPA裂解液吗？是自己配置的还是买现成的效果会好一点？如果买买哪个牌子的好一点？还有PMSF是买哪个品牌的好一点？ 能给我发一下你们平常实验的具体实验步骤吗？ 像PMSF、裂解液的浓度和每mg肝脏的用量， 超声的条件设置，从南京建成给的实验方法学看到的可以用国产超声波发生仪400安培，5秒/次，间歇反复3-5次。这样操作可以吗？ 刚接触电泳实验，不懂的很多问题有点多，麻烦您解答一下  |
5楼2013-08-27 18:52:07
6楼2013-08-27 18:58:21
ritchiejin
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我在百度百科上查了RIPA裂解液的说明，RIPA主要是从动物组织和动物细胞中抽取的可溶性蛋白的。那么脂溶性蛋白很有可能就丢失了。但是每种提取蛋白的方法都有优劣，也都会丢失部分蛋白。如果条件允许，你可以都尝试一下，确定你所关注的差异点可能存在于胶图的哪一段pH值内，进而选择针对这段pH值的蛋白提取的方法（如酸性区域蛋白或碱性区域蛋白）。商业化的裂解液我个人认为都一样是配出来的，只要自己选用进口的试剂，严格的操作，质量不会比他们差。我们的裂解液都是自己配的，PMSF用的是sigma的。超声的话，我们是400W，2s超声+6s间隔，冰浴，因为我们用的是1.5mlEP管装的，体积小，所以很害怕超声的时候发热，蛋白变性。 |
7楼2013-08-28 14:55:24
