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关包子

银虫 (小有名气)

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专业: 蛋白质组学

[求助] 蛋白纯化阶段出现问题

用his-tag标签法纯化蛋白，竟然没有目的蛋白，给沉淀、上清、流出液跑电泳也没有出现目标条带！基因根本没有表达……

表达载体测（含抗氨苄基因）序结果是没问题的。以M15/rep4做感受态菌的转化，转化后，有菌落在双抗（氨苄和卡那）培养基上长出。我用这种菌落去纯化蛋白……

为什么没有表达啊

恳请各位前辈给一些建议，我下一步该怎么做啊！小弟真的是太郁闷了

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为自己的梦想而努力

1楼 2013-08-23 19:31:35

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fantasist001

铁虫 (初入文坛)

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【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-24 02:06:28

在你的表达元件及基因序列都正常的前提下：
首先确认你的表达菌株对你的载体是合适的，如用T7 promoter需要特殊的菌株BL21（DE3）或其衍生菌株。
其次确保你的诱导试剂依然有效，浓度合适。
如上面两项都对还未表达，估计需要考虑换载体、菌株（如密码子校正菌株）、部分表达、甚至使用真核表达体系等复杂变动了。