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关包子

银虫 (小有名气)

[求助] 蛋白纯化阶段出现问题

用his-tag标签法纯化蛋白,竟然没有目的蛋白,给沉淀、上清、流出液跑电泳也没有出现目标条带!基因根本没有表达……

  表达载体测(含抗氨苄基因)序结果是没问题的。以M15/rep4做感受态菌的转化,转化后,有菌落在双抗(氨苄和卡那)培养基上长出。我用这种菌落去纯化蛋白……

  为什么没有表达啊

  恳请各位前辈给一些建议,我下一步该怎么做啊!小弟真的是太郁闷了
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为自己的梦想而努力
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fantasist001

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-08-24 02:06:28
在你的表达元件及基因序列都正常的前提下:
首先确认你的表达菌株对你的载体是合适的,如用T7 promoter需要特殊的菌株BL21(DE3)或其衍生菌株。
其次确保你的诱导试剂依然有效,浓度合适。
如上面两项都对还未表达,估计需要考虑换载体、菌株(如密码子校正菌株)、部分表达、甚至使用真核表达体系等复杂变动了。
3楼2013-08-23 21:26:31
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2008101111

金虫 (正式写手)

学术江湖混子

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-08-24 02:06:21
就算载体构建成功,转化到表达菌也成功了,但就是会遇到蛋白就是不表达的现象,这种情况下,可以优化摸索诱导条件,如果还不行,就只能换载体和表达菌株了
自主创业者,捣腾生物试剂
2楼2013-08-23 21:03:58
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