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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于PCR和PAGE胶
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hyc_charles

金虫 (小有名气)

[交流] 关于PCR和PAGE胶

这段时间一直在做分子标记，被PCR整的够呛，卡在选扩这已经2个月了，产物总是时有时无，同样的材料重复一次，结果都会不一样或者什么都没有了，换了所有的试剂，换了新设计的引物，结果一样，真是快崩溃了。
另外就是PAGE胶，跑过的人都知道，这个也是很熬人的，做一次大半天就耗进去了，但扩增产物又只能用这个来检测，不然看不清楚，跑胶真是门艺术，中间的不可控步骤太多，这些都会造成你的结果不同。
有没有经验人士，遇到同样的问题，大家交流交流~
祝大伙实验顺利！！
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1楼 2013-07-22 18:50:49
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不卑微的我

银虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我现在也是碰到同样的问题。之前一直蛮顺利，最近选扩总是弥散，不知道什么原因。
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2楼2013-07-23 09:26:46
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liyongliangx

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-07-23 11:15:11
我之前也遇到过这样的问题。有点经验可以和你说说
一，关于弥散的问题，你首先要确定你的模板没有问题，可以跑个胶看一看大小，也可以做个测序。然后PCR时候做个阴性对照，排除是不是污染造成的。
二，你要找到模板和引物量的比例，可能是你模板量太多，也可能是引物太多。我比较推荐1ng/UL的模板浓度，引物可以用10uM和5uM都试试。
三，就是你操作的问题，要看你的是什么样的酶。反应体系最好按着说明书上做。注意一点说明书上note 内容：比如在冰上配体系，然后等到PCR仪进入到变性温度的时候再把PCR管放到PCR仪里。
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43289899
3楼2013-07-23 10:14:43
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hyc_charles

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 不卑微的我 at 2013-07-23 09:26:46
我现在也是碰到同样的问题。之前一直蛮顺利，最近选扩总是弥散，不知道什么原因。

加油加油，坚持顶住，我还真不信我做不出来了！
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不卑微的我
4楼2013-07-23 12:47:05
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hyc_charles

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by liyongliangx at 2013-07-23 10:14:43
我之前也遇到过这样的问题。有点经验可以和你说说
一，关于弥散的问题，你首先要确定你的模板没有问题，可以跑个胶看一看大小，也可以做个测序。然后PCR时候做个阴性对照，排除是不是污染造成的。
二，你要找到模 ...

谢谢，前面两步我都做了验证，引物也是浓度10μM的，我用的TAQ酶是国产的，没有说明书的说- -，takara的酶倒是按照说明书的做的，但是现在用完了。
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5楼2013-07-23 12:50:10
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43289899

银虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by liyongliangx at 2013-07-23 10:14:43
我之前也遇到过这样的问题。有点经验可以和你说说
一，关于弥散的问题，你首先要确定你的模板没有问题，可以跑个胶看一看大小，也可以做个测序。然后PCR时候做个阴性对照，排除是不是污染造成的。
二，你要找到模 ...

我也遇到了这样的问题，您说的方法感觉很靠谱，我试试，先送花一朵
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6楼2013-07-24 09:50:54
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不卑微的我

银虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by hyc_charles at 2013-07-23 12:47:05
加油加油，坚持顶住，我还真不信我做不出来了！...

嗯 顶住。我已经做了20多天了，看三楼分析的挺好。找到原因分享一下哦
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7楼2013-07-24 12:55:44
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hyc_charles

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 不卑微的我 at 2013-07-24 12:55:44
嗯 顶住。我已经做了20多天了，看三楼分析的挺好。找到原因分享一下哦...

现在还在改进中，一旦有结果，我会发文章出来的，到时候供大家参考
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8楼2013-07-24 13:46:00
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tyh126

银虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流经验！ 2013-08-30 21:41:13
你把你的实验扩增体系好好摸索摸索   能跑出来漂亮的    相信我  之前我饿很烦恼  后来出来了  特别好  你试试
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9楼2013-08-30 11:46:11
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