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hyc_charles

金虫 (小有名气)

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[交流] 关于PCR和PAGE胶

这段时间一直在做分子标记，被PCR整的够呛，卡在选扩这已经2个月了，产物总是时有时无，同样的材料重复一次，结果都会不一样或者什么都没有了，换了所有的试剂，换了新设计的引物，结果一样，真是快崩溃了。
另外就是PAGE胶，跑过的人都知道，这个也是很熬人的，做一次大半天就耗进去了，但扩增产物又只能用这个来检测，不然看不清楚，跑胶真是门艺术，中间的不可控步骤太多，这些都会造成你的结果不同。
有没有经验人士，遇到同样的问题，大家交流交流~
祝大伙实验顺利！！

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1楼 2013-07-22 18:50:49

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不卑微的我

银虫 (初入文坛)

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★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖

我现在也是碰到同样的问题。之前一直蛮顺利，最近选扩总是弥散，不知道什么原因。

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2楼2013-07-23 09:26:46

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liyongliangx

铜虫 (小有名气)

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★ ★ ★ ★
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kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-07-23 11:15:11

我之前也遇到过这样的问题。有点经验可以和你说说
一，关于弥散的问题，你首先要确定你的模板没有问题，可以跑个胶看一看大小，也可以做个测序。然后PCR时候做个阴性对照，排除是不是污染造成的。
二，你要找到模板和引物量的比例，可能是你模板量太多，也可能是引物太多。我比较推荐1ng/UL的模板浓度，引物可以用10uM和5uM都试试。
三，就是你操作的问题，要看你的是什么样的酶。反应体系最好按着说明书上做。注意一点说明书上note 内容：比如在冰上配体系，然后等到PCR仪进入到变性温度的时候再把PCR管放到PCR仪里。

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43289899

3楼2013-07-23 10:14:43

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hyc_charles

金虫 (小有名气)

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引用回帖:

2楼: Originally posted by 不卑微的我 at 2013-07-23 09:26:46
我现在也是碰到同样的问题。之前一直蛮顺利，最近选扩总是弥散，不知道什么原因。

加油加油，坚持顶住，我还真不信我做不出来了！

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不卑微的我

4楼2013-07-23 12:47:05

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hyc_charles

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引用回帖:

3楼: Originally posted by liyongliangx at 2013-07-23 10:14:43
我之前也遇到过这样的问题。有点经验可以和你说说
一，关于弥散的问题，你首先要确定你的模板没有问题，可以跑个胶看一看大小，也可以做个测序。然后PCR时候做个阴性对照，排除是不是污染造成的。
二，你要找到模 ...

谢谢，前面两步我都做了验证，引物也是浓度10μM的，我用的TAQ酶是国产的，没有说明书的说- -，takara的酶倒是按照说明书的做的，但是现在用完了。

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5楼2013-07-23 12:50:10

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